膜異位hMSH2分子促進(jìn)γδT細(xì)胞對肺癌細(xì)胞的體外細(xì)胞毒活性.pdf

1、人γδT細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞中的一個(gè)特殊亞群，具有天然免疫細(xì)胞的諸多特征，是聯(lián)系固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的橋梁，在機(jī)體免疫監(jiān)視和抗腫瘤免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要的作用。γδT細(xì)胞因其主要組織相容性復(fù)合物(Major histocompatibility complex，MHC)非限制性的、廣譜的腫瘤抗原識別模式、快速活化的效應(yīng)機(jī)制、強(qiáng)大的細(xì)胞毒作用和多種抗腫瘤效應(yīng)性細(xì)胞因子的分泌能力，在腫瘤的免疫細(xì)胞治療中備受重視。
　　γδT細(xì)胞可直接

2、識別多種抗原分子，研究最多的是小分子磷酸鹽抗原，基于磷酸化抗原擴(kuò)增Vγ9Vδ2T細(xì)胞的過繼細(xì)胞治療早已進(jìn)入臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗(yàn)。此外，γδT細(xì)胞還可識別一些應(yīng)激條件誘導(dǎo)的、在細(xì)胞表面異位表達(dá)的蛋白類配體。本課題組前期研究成果表明，人MutS同源蛋白2（Human MutS homologue2，hMSH2）是γδT細(xì)胞識別的腫瘤相關(guān)蛋白類抗原。
　　hMSH2分子是DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的一個(gè)重要成員，主要在細(xì)胞質(zhì)中合成，與系統(tǒng)其他成員h

3、MSH3或hMSH6分子形成異源二聚體進(jìn)入細(xì)胞核中，參與損傷或錯(cuò)配的DNA的修復(fù)過程。在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，均可以檢測到hMSH2基因突變或蛋白功能異常。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中采用基于T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)δ鏈的互補(bǔ)決定區(qū)3（Complementary determining region3，CDR3）結(jié)合特性的篩選策略，篩選到hMSH2分子是γδT細(xì)胞識別的腫瘤相關(guān)配體。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，hMSH2分子

4、在多種腫瘤細(xì)胞膜表面呈廣泛的、不同水平的異位表達(dá)。除了腫瘤之外，在病毒感染及氧化應(yīng)激的情況下，hMSH2分子也能異位表達(dá)于細(xì)胞膜表面。膜異位表達(dá)的hMSH2分子被γδT細(xì)胞受體(γδT cell receptor，TCRγδ)和NK細(xì)胞受體成員2D(Natural killer group2member D，NKG2D)雙重識別后，參與介導(dǎo)γδT細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷或清除作用。但是，目前異位表達(dá)的hMSH2分子介導(dǎo)γδT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的

5、相關(guān)機(jī)制仍不清楚，澄清hMSH2分子介導(dǎo)γST細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的相關(guān)機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示γδT細(xì)胞在腫瘤免疫監(jiān)視及抗腫瘤免疫中的重要作用。另外，研究hMSH2分子在促進(jìn)γδT細(xì)胞細(xì)胞毒活性方面的效應(yīng)，對于優(yōu)化基于γδT細(xì)胞的腫瘤過繼免疫治療策略具有重要意義。
　　本研究通過構(gòu)建hMSH2分子過表達(dá)的肺癌細(xì)胞模型，探索膜表面異位表達(dá)的hMSH2分子介導(dǎo)γδT細(xì)胞殺傷肺癌細(xì)胞的相關(guān)機(jī)制，并研究hMSH2分子在促進(jìn)γδT細(xì)胞的細(xì)胞毒活

6、性方面的效應(yīng)。首先，檢測了4種常用的人肺癌細(xì)胞系(NCI-H520，GLC-82，NCI-H1703及NCI-H446)及人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5細(xì)胞表面膜hMSH2分子的異位表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同肺癌細(xì)胞系膜表面hMSH2的表達(dá)情況差異較大，從中選擇了細(xì)胞膜表面hMSH2分子低表達(dá)的NCI-H520細(xì)胞作為構(gòu)建過表達(dá)hMSH2分子的肺癌細(xì)胞模型。利用構(gòu)建的重組表達(dá)載體cFugw-hMSH2轉(zhuǎn)染NCI-H520細(xì)胞，瞬時(shí)表達(dá)hMSH

7、2-EGFP融合蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后NCI-H520細(xì)胞膜表面的hMSH2分子水平顯著上調(diào)，陽性細(xì)胞比例從原先的12.67±0.80％升高到62.53±8.22％。體外細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，hMSH2分子在NCI-H520細(xì)胞細(xì)胞膜異位表達(dá)水平的升高能有效增強(qiáng)γδT細(xì)胞對其的細(xì)胞毒活性。在檢測對殺傷過程中γδT細(xì)胞的活化及細(xì)胞毒相關(guān)效應(yīng)分子的水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，在與過表達(dá)hMSH2的NCI-H520細(xì)胞相互作用后，γST細(xì)胞活化相關(guān)分子CD

8、69和CD107a的表達(dá)水平顯著升高，并分泌更多的抗腫瘤細(xì)胞因子γ-干擾素(IFN-γ)與腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。這一結(jié)果提示，hMSH2分子可能是通過促進(jìn)γδT細(xì)胞的活化、脫顆粒作用及抗腫瘤細(xì)胞因子IFN-γ與TNF-α的分泌來增強(qiáng)γδT細(xì)胞對肺癌細(xì)胞NCI-H520的體外細(xì)胞毒活性。另外，還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)小分子磷酸鹽抗原唑來膦酸(Zoledronic acid，ZOL)處理后，γδT細(xì)胞對NCI-H520細(xì)胞的殺傷活性增加，并且呈

9、現(xiàn)一定的劑量依賴性;同時(shí)，在相同條件的唑來膦酸預(yù)處理組中，γδT細(xì)胞對hMSH2分子膜異位表達(dá)上調(diào)的NCI-H520細(xì)胞的殺傷效率明顯高于對野生型NCI-H520細(xì)胞。由此可見，hMSH2分子在促進(jìn)γδT細(xì)胞體外殺傷肺癌細(xì)胞系NCI-H520細(xì)胞的活性方面，與唑來膦酸存在協(xié)同效應(yīng)，提示二者能協(xié)同用于抗腫瘤免疫治療。
　　綜上，本研究得出以下主要結(jié)論:1、細(xì)胞膜異位表達(dá)的hMSH2分子參與介導(dǎo)γδT細(xì)胞對肺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，其膜異