人類γδT細胞配體分子MutS同源蛋白2-應(yīng)激性膜異位表達的信號調(diào)控機制及在細胞惡變中的膜異位表達.pdf

1、人類γδT細胞具有天然免疫細胞特征，可直接識別某些應(yīng)激誘導(dǎo)的、細胞表面異常表達的抗原分子并啟動γδT細胞的早期活化，在清除病原體和維持機體免疫穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮了重要作用。
　　 人MutS同源蛋白2(Human MutS homologue 2，hMSH2)是DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)成員之一，主要在胞漿合成，并在細胞核內(nèi)發(fā)揮DNA損傷的錯配修復(fù)作用。hMSH2缺陷或表達異常多見于各種腫瘤細胞。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，hMSH2在正常細胞

2、膜上幾乎不表達，而在腫瘤細胞膜表面呈廣泛的異位表達。這種膜異位表達能被Epstein-barr病毒(Epstein-barr virus，EBV)感染所誘導(dǎo)。異位表達的hMSH2可為γδT細胞受體（γδT cell receptor,TCRγδ）和NK細胞受體成員2D(Natural killer group 2 member D，NKG2D)雙重識別，從而促進γδT細胞對病毒感染細胞的清除。然而，目前hMSH2膜異位表達的調(diào)控方式尚不

3、明確。澄清γδT細胞應(yīng)激性配體分子膜表達的分子機制，將有助于進一步揭示γδT細胞在免疫監(jiān)視中的重要作用。
　　 鑒此，本研究主要針對以下三個科學(xué)問題展開：一是hMSH2是否為γδT細胞的應(yīng)激性配體分子？二是hMSH2應(yīng)激性膜異位表達的信號調(diào)控機制是什么？三是細胞惡變過程中，hMSH2的膜異位表達變化及其對γδT細胞殺傷惡變細胞存在什么影響？本文分兩部分就上述三個科學(xué)問題進行研究，證實了hMSH2是γδT細胞的應(yīng)激性配體分子，并發(fā)

4、現(xiàn)MAPK家族的p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38-MAPK)通路和應(yīng)激活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶(Stress-activated protein kinase/c-Jun N-terminal kinase，SAPK-JNK)通路是調(diào)控hMSH2應(yīng)激性膜異位表達的重要信號通路，初步揭示了細胞的惡變過程可伴隨著hMSH2膜異位表達水平升高的規(guī)律性變化。<

5、br>　　 本研究的第一部分包括三項內(nèi)容。第一項內(nèi)容旨在證實應(yīng)激環(huán)境中，hMSH2在腫瘤細胞上的膜異位表達是否具有可誘導(dǎo)性。通過建立熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激等細胞應(yīng)激模型，分析了hMSH2應(yīng)激時膜異位表達情況。流式細胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)檢測結(jié)果表明，hMSH2在腎癌細胞表面呈低水平的組成性表達;應(yīng)激環(huán)境中，hMSH2膜異位表達呈不同程度上調(diào)，其中以氧化應(yīng)激誘導(dǎo)hMSH2膜異位趨勢最明顯（從8～10％上調(diào)至40～50％）

6、，而抗氧化劑N.乙酰半胱氨酸（Ⅳ-acetyl-L-cysteine，NAC）能抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的hMSH2膜異位表達（從40～50％下調(diào)至6～10％），提示hMSH2的膜異位表達可能被應(yīng)激環(huán)境所誘導(dǎo)。隨后，在幾種對γδT細胞殺傷作用敏感的血液來源腫瘤細胞（黑素瘤、淋巴瘤和白血病腫瘤）中，證實了hMSH2在腫瘤細胞膜上的異位表達具有可誘導(dǎo)性。運用實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)和免疫

7、印跡技術(shù)，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)hMSH2 mRNA及總蛋白表達水平升高，提示氧化應(yīng)激可能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)hMSH2的表達。本研究還發(fā)現(xiàn)，hMSH2與γδT細胞經(jīng)典的應(yīng)激性配體分子MHC-classⅠ類鏈相關(guān)抗原A/B(MHC-class I chain related A and B，MICA/B)在胞膜的應(yīng)激性表達上調(diào)趨勢一致，進一步證實了應(yīng)激環(huán)境中，hMSH2在腫瘤細胞上的膜異位表達具有可誘導(dǎo)性，提示該分子可能為危險相關(guān)分子模式(Dan

8、ger associated molecular pattern，DAMP)家族的成員。
　　 本研究第一部分的第二項工作，是利用腎癌細胞建立的氧化應(yīng)激模型，探討了hMSH2應(yīng)激性膜異位表達的信號調(diào)控機制。Western blot結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激時MAPK家族的p38-MAPK、SAPK-JNK和絲裂原活化蛋白／胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Mitogen-activated protein/extracellular signal-re

9、gulated kinase，MEK-ERK)通路均處于磷酸化活化狀態(tài)。利用qRT-PCR、FCM和Western blot技術(shù)聯(lián)合三條信號通路特異性抑制劑，對應(yīng)激前后hMSH2 mRNA、膜異位和總蛋白表達進行分析，初步證實了p38-MAPK和SAPK-JNK通路主要參與應(yīng)激時hMSH2膜異位表達的調(diào)控，而未見MEK/ERK通路發(fā)揮調(diào)控作用。進而，當促進p38-MAPK和SAPK-JNK通路上游共同的結(jié)點激酶——凋亡信號激酶1(Apo

10、ptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)活化時，hMSH2在腎癌細胞上的膜異位表達上調(diào)，驗證了上述兩條通路對hMSH2膜異位表達的調(diào)節(jié)作用。采用qRT-PCR和Wesetern blot方法，發(fā)現(xiàn)p38-MAPK和SAPK-JNK通路下游的激活轉(zhuǎn)錄因子3(Activating transcription factor 3，ATF3)對氧化應(yīng)激敏感，且hMSH2調(diào)控區(qū)存在ATF3的結(jié)合位點。運用小RN

11、A干擾（Small interference RNA，siRNA）技術(shù)靶向敲低腎癌細胞ATF3表達時，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的hMSH2膜異位表達水平明顯降低，而MICA/B的膜表達變化不明顯，提示氧化應(yīng)激時ATF3對hMSH2膜異位表達的調(diào)控作用可能具有特異性。
　　 本研究第一部分的第三項內(nèi)容，旨在進一步確定氧化應(yīng)激誘導(dǎo)hMSH2膜異位表達中關(guān)鍵的影響因素。運用酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme linked immunosorbent

12、assay,ELISA)，證實了氧化應(yīng)激能促進腎癌細胞自分泌白細胞介素(Interleukin，IL)-18。FCM結(jié)果表明，腎癌細胞組成性表達IL-18受體α(Interleukin 18 receptorα，IL-18Rα)，且其表達呈應(yīng)激性上調(diào)。給予腎癌細胞外源性IL-18作用時，hMSH2的膜異位表達上調(diào)。利用siRNA技術(shù)敲低腎癌細胞IL-18Rα表達時，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)腎癌細胞自分泌的IL-18，對hMSH2膜異位表達發(fā)揮了

13、直接的促進作用。運用ELISA和胞內(nèi)免疫熒光染色技術(shù)，證實了氧化應(yīng)激可刺激γδT細胞分泌干擾素(Interferon，IFN).-γ，且外源性IFN-γ可進一步增強hMSH2的應(yīng)激性膜異位表達。同時，氧化應(yīng)激、外源性IL-18或IFN-γ作用能有效增強γδT細胞對腎癌細胞的殺傷作用。由此，氧化應(yīng)激中γδT細胞產(chǎn)生的IFN-7可能上調(diào)hMSH2在腫瘤細胞上的膜異位表達，且誘導(dǎo)hMSH2膜異位表達的因素可促進γδT細胞清除腎癌細胞。

14、　　 由于hMSH2的膜異位表達主要存在于上皮及血液來源的腫瘤細胞而非正常細胞表面，因此本研究的第二部分內(nèi)容，分析了腎正常上皮細胞系HK-2在受到三甲基膽葸（3-methylcholanthrene,3-MCA）誘變時，hMSH2的膜異位表達變化。通過分析HK-2細胞形態(tài)和染色體數(shù)目，利用刀豆蛋白A(ConcanavalinA，ConA)凝集試驗和軟瓊脂克隆形成試驗，證實了3-MCA可誘導(dǎo)HK-2細胞發(fā)生一定程度的惡性轉(zhuǎn)變。同時，F(xiàn)C

15、M檢測發(fā)現(xiàn)hMSH2膜表達出現(xiàn)相應(yīng)的上調(diào)。在誘變后期，hMSH2的膜表達在30～40％，且異位表達的hMSH2促進了γδT細胞對惡變細胞的殺傷。
　　 綜上，本研究得出以下主要結(jié)論：
　　 1、應(yīng)激環(huán)境可誘導(dǎo)hMSH2在腫瘤細胞上膜異位表達上調(diào);
　　 2、氧化應(yīng)激時p38-MAPK和SAPK-JNK是調(diào)控hMSH2應(yīng)激性膜異位的重要信號通路;
　　 3、氧化應(yīng)激刺激腎癌細胞自分泌的IL-18和γδT細胞

16、產(chǎn)生的IFN-γ可促進hMSH2在腎癌細胞上膜異位表達，并增強γδT細胞對相應(yīng)靶細胞的殺傷作用;
　　 4、化學(xué)誘變引發(fā)的細胞惡變過程可伴隨著hMSH2膜異位表達上調(diào)。
　　 本研究的創(chuàng)新點：
　　 1、證實γδT細胞配體分子hMSH2具有應(yīng)激性膜異位表達特征，提示hMSH2可能為DAMP成員，是應(yīng)激環(huán)境中向γδT細胞預(yù)警的靶標分子;
　　 2、首次報道氧化應(yīng)激時，p38-MAPK和SAPK-JNK通路為