人類(lèi)γδT細(xì)胞對(duì)內(nèi)源性配體分子人MutS同源蛋白2的識(shí)別機(jī)制及相關(guān)天然免疫監(jiān)視作用研究.pdf

1、人類(lèi)γδT細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞中的一個(gè)特殊群體,在機(jī)體抗腫瘤及抗感染免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。然而,由于已發(fā)現(xiàn)和鑒定出的抗原(或配體)數(shù)量有限,且缺乏相應(yīng)的反應(yīng)性亞克隆T細(xì)胞抗原識(shí)別受體(T cell receptor,TCR)的結(jié)構(gòu)信息,γδT細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞之間相互作用的分子機(jī)制尚有待于進(jìn)一步闡明。
　　 人類(lèi)MutS同源蛋白2(Human MutS homologue2,hMSH2)是DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白家族的一個(gè)重

2、要成員,通常定位于細(xì)胞核并與hMSH3或hMSH6形成異源二聚體,參與修復(fù)DNA合成中的堿基錯(cuò)配,以保證基因組的忠實(shí)性。遺傳性或獲得性的hMSH2缺陷與諸多癌癥的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。在前期的研究工作中,本實(shí)驗(yàn)室采用基于TCR互補(bǔ)決定區(qū)36鏈(Complementary determining region36chain,CDR3δ)肽結(jié)合特性的免疫親和篩選技術(shù)策略,用OT3肽探針從卵巢癌細(xì)胞系SKOV3的細(xì)胞提取物中釣取了三個(gè)可能

3、被Vδ2 TCR識(shí)別的配體,hMSH2是其中之一。初步的研究結(jié)果表明,hMSH2在SKOV3的細(xì)胞表面有異位表達(dá),γδT細(xì)胞對(duì)SKOV3細(xì)胞的殺傷作用亦可為抗hMSH2抗體(Antibody,Ab)部分封閉。鑒于此,我們推測(cè)hMSH2是一個(gè)能為γδT細(xì)胞所識(shí)別的、腫瘤相關(guān)的內(nèi)源性抗原(或配體)分子。本研究旨在對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證,并進(jìn)一步探討γδT細(xì)胞識(shí)別hMSH2的分子機(jī)制及hMSF12在γδT細(xì)胞介導(dǎo)的天然免疫監(jiān)視應(yīng)答中的作用和意義。

4、>　　 本文的第一項(xiàng)研究?jī)?nèi)容旨在探索hMSH2的膜異位表達(dá)在上皮腫瘤細(xì)胞中是否具有普遍意義。針對(duì)此問(wèn)題,分析了宮頸癌、胃癌、肺癌、結(jié)直腸癌及卵巢癌腫瘤細(xì)胞系HeLa、803、NCI-H520、HR8348、SKOV3、HO8910及ES-2細(xì)胞中hMSH2的基因序列、mRNA水平及蛋白質(zhì)表達(dá)情況,并對(duì)這五種腫瘤病人癌組織標(biāo)本中hMSH2的分布進(jìn)行了分析。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明,hMSH2在受測(cè)的七種上皮腫瘤細(xì)胞表面均存在異位表達(dá)(陽(yáng)性

5、率14.2～68.2％),而在正常對(duì)照細(xì)胞HK-2、成纖維細(xì)胞及γδT細(xì)胞表面則幾乎沒(méi)有表達(dá)(陽(yáng)性率<2.2％),提示hMSH2的膜異位表達(dá)在上皮腫瘤細(xì)胞中可能具有普遍意義。激光共聚焦掃描顯微鏡術(shù)和免疫組織化學(xué)染色分析的結(jié)果也顯示,hMSH2在上皮腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)異常的亞細(xì)胞分布,表現(xiàn)為廣泛的胞膜、胞質(zhì)異位表達(dá),胞核分布則多減弱或消失?；驕y(cè)序結(jié)果表明,hMSH2的藎因序列在大多數(shù)上皮腫瘤細(xì)胞系中并無(wú)突變,其mRNA表達(dá)水平在不同上皮腫瘤

6、細(xì)胞系問(wèn)也存在較大差異。
　　 hMSH2在上皮腫瘤細(xì)胞表面不尋常的異位表達(dá)為其作為γδT細(xì)胞識(shí)別的配體提供了可能。因此,本文的第二項(xiàng)研究?jī)?nèi)容重點(diǎn)驗(yàn)證了γδT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞膜異位表達(dá)的hMSH2的識(shí)別作用。首先,運(yùn)用抗體殺傷封閉實(shí)驗(yàn),在HeLa、803及NCI—H520細(xì)胞中初步證實(shí)了hMSH2的膜異位表達(dá)與γδT細(xì)胞對(duì)上皮腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用間存在聯(lián)系。其次,運(yùn)用小RNA干擾(Small interference RNA,si

7、RNA)技術(shù)靶向沉默HeLa、803及NCI-H520細(xì)胞中hMSH2的表達(dá),并比較γδT細(xì)胞對(duì)干擾組及Mock組殺傷效率的差異。結(jié)果表明,異位表達(dá)的hMSH2的確能被γδT細(xì)胞識(shí)別,并參與γδT細(xì)胞對(duì)上皮細(xì)胞腫瘤的免疫監(jiān)視作用。隨后,通過(guò)殺傷實(shí)驗(yàn)及重組hMSH2(Recombinant hMSH2,rhMSH2)體外刺激實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)Vδ2 T細(xì)胞是hMSH2的主要反應(yīng)性γδT細(xì)胞亞群。最后,通過(guò)對(duì)HeLa、803及NCI-H520細(xì)

8、胞膜蛋白的分離純化Western blot分析,鑒定出上皮腫瘤細(xì)胞膜異位表達(dá)的hMSH2為分子量(Molecular weight,MW)約105千道爾頓(Kilodalton,kDa)的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)。
　　 由于Vδ2 T細(xì)胞組成性地表達(dá)NKG2D受體,且有研究表明γδT細(xì)胞的某些配體分子如MHCⅠ類(lèi)分子鏈相關(guān)抗原A和B(MHC classⅠ-related chains A and B,MICA/B)、UL16結(jié)合蛋白4(UL

9、16-binding protein4,ULBP4)等存在TCR及NKG2D雙重識(shí)別機(jī)制,本文的第三項(xiàng)研究?jī)?nèi)容著重探討了γδT細(xì)胞對(duì)hMSH2的識(shí)別是否同樣存在TCRγδ及NKG2D雙重途徑。首先,用抗體封閉與siRNA干擾相結(jié)合的方法,研究TCRγδ和/或NKG2D封閉是否能夠抑制膜異位表達(dá)hMSH2所介導(dǎo)的γδT細(xì)胞(或NK-92細(xì)胞)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別與殺傷作用；其次,將rhMSH2蛋白在體外與γδT細(xì)胞預(yù)孵育,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析rh

10、MSH2對(duì)TCRγδ及NKG2D的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合作用;此外,運(yùn)用表面離子共振技術(shù)(Surface plasmon resonance,SPR)對(duì)NKG2D與rhMSH2的直接結(jié)合作用及親和力進(jìn)行了進(jìn)一步分析。結(jié)果顯示,hMSH2介導(dǎo)的γδT細(xì)胞(或NK-92細(xì)胞)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別與殺傷能被anti—TCRγδ和/或anti-NKG2D Ab封閉所抑制；rhMSH2能競(jìng)爭(zhēng)性地與TCRγδ及NKG2D結(jié)合；NKG2D能直接與rhMSH2結(jié)合,K

11、d值為132 nM。這些結(jié)果說(shuō)明γδT細(xì)胞對(duì)hMSH2的識(shí)別存在TCRγδ及NKG2D雙重途徑。
　　 γδT細(xì)胞在抗病毒感染免疫中發(fā)揮著重要作用。γδT細(xì)胞識(shí)別的某些內(nèi)源性抗原(或配體)分子,如熱休克蛋白(Heat shock protein,HSP)90、HSP60及ULBPs等,在病毒感染細(xì)胞中出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)。因此,本文的第四項(xiàng)研究?jī)?nèi)容通過(guò)建立Epstein-barr病毒(Epstein-barr virus,EBV)轉(zhuǎn)化細(xì)

12、胞模型,觀察hMSH2在EBV轉(zhuǎn)化類(lèi)淋巴母細(xì)胞中的農(nóng)達(dá)變化及這種變化對(duì)γδT細(xì)胞清除病毒感染細(xì)胞作用的影響,進(jìn)一步研究了hMSH2在γδT細(xì)胞介導(dǎo)的病毒感染免疫監(jiān)視中的作用。結(jié)果表明,EBV感染細(xì)胞hMSH2的轉(zhuǎn)錄水平及膜異位表達(dá)均明顯增高；膜異位表達(dá)的hMSH2亦介導(dǎo)了γδT細(xì)胞對(duì)EBV感染細(xì)胞的識(shí)別,并顯著增強(qiáng)了γδT細(xì)胞的靶向殺傷作用。這提示hMSH2可能如γδT細(xì)胞識(shí)別的大多數(shù)內(nèi)源性抗原(或配體)一樣具有應(yīng)激分子的特性,且在γδ

13、T細(xì)胞介導(dǎo)的抗EBV感染免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。
　　 綜上所述,本文得出的主要結(jié)論如下:(1)hMSH2的膜異位表達(dá)在上皮腫瘤細(xì)胞中具有一定的普遍性；(2)異位表達(dá)的hMSH2能被γδT細(xì)胞的抗原識(shí)別受體TCRγδ和NKG2D雙重識(shí)別,并主要參與Vδ2 T細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用;(3)上皮腫瘤細(xì)胞膜異位表達(dá)的hMSH2為MW約105 kDa的全長(zhǎng)蛋白;(4)hMSH2的異位表達(dá)能被EBV感染所誘導(dǎo),并顯著增強(qiáng)γδT細(xì)胞

14、對(duì)病毒感染細(xì)胞的清除作用。
　　 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)體現(xiàn)在:一是初步驗(yàn)證了hMSH2的膜異位表達(dá)在上皮腫瘤細(xì)胞中具有一定的普遍性,提示hMSH2可能是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的上皮腫瘤標(biāo)志分子；二是首次證明hMSH2作為一個(gè)腫瘤相關(guān)的內(nèi)源性抗原分子,能通過(guò)TCRγδ及NKG2D雙重識(shí)別途徑被γδT細(xì)胞識(shí)別,為γδT細(xì)胞識(shí)別的抗原(或配體)譜增添了新的分子,揭示了γδT細(xì)胞識(shí)別、殺傷上皮來(lái)源腫瘤細(xì)胞的新的分子機(jī)制；三是首次報(bào)道了hMSH2分子在EB

15、V感染細(xì)胞中的誘導(dǎo)表達(dá),并闡明了該分子在γδT細(xì)胞介導(dǎo)的抗EBV感染免疫中的作用,揭示了γδT細(xì)胞識(shí)別和清除EBV病毒感染細(xì)胞的新的分子機(jī)制,豐富了目前對(duì)γδT細(xì)胞在病毒感染免疫中重要作用的認(rèn)識(shí)。
　　 總之,本文通過(guò)對(duì)上皮來(lái)源腫瘤細(xì)胞及EBV轉(zhuǎn)化B細(xì)胞表面hMSH2的異位表達(dá)及γδT細(xì)胞對(duì)其識(shí)別機(jī)制的深入研究,進(jìn)一步揭示了γδT細(xì)胞免疫監(jiān)視的新型作用方式,為全面闡明γδT細(xì)胞的生物學(xué)功能提供了新的線(xiàn)索,亦為建立新的腫瘤及病毒感