內源性載脂蛋白O對脂肪細胞分泌功能的影響及機制初探.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景:
  載脂蛋白O(apolipoprotein O,apoO)是2006年新發(fā)現(xiàn)的一種載脂蛋白,目前對其生理功能的認識知之甚少。生理情況下apoO的平均血漿濃度極低,僅為2.21±0.83μg/ml。即使分泌型apoO主要存在于高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)中,但apoO與HDL膽固醇水平及其他血脂成分并無相關性,且過表達apoO也不影響HDL的質量和功能,提示分泌到血漿中的apoO

2、作用十分有限。
  除作為分泌型蛋白在細胞外發(fā)揮作用,apoO還可滯留于細胞內調節(jié)細胞代謝。急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)患者apoO的血漿濃度明顯升高,并且與炎癥指標高敏C反應蛋白(high-sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)水平呈顯著正相關性,由此推測apoO可能與機體炎癥狀態(tài)有關。與此一致的是,采用小RNA干擾(small interferi

3、ng RNA,siRNA)技術沉默細胞內apoO表達后,多種炎癥相關基因的表達明顯改變,但apoO是否在細胞內發(fā)揮調節(jié)炎癥應答的作用及可能的調節(jié)途徑均尚屬未知。基于脂肪細胞可大量合成apoO,而脂肪細胞炎癥激活所致分泌功能異常在肥胖及動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用,深入探討內源性apoO對脂肪細胞分泌功能的影響,對揭示apoO的生理功能以及肥胖等相關疾病的發(fā)病機制具有重要意義。
  目的:
  探討內源性apoO是否

4、參與調控脂肪細胞炎癥應答,以及apoO影響脂肪細胞分泌功能的可能作用機制。
  方法
  一.載脂蛋白O對人脂肪細胞分泌功能的影響
  由行腹部外科手術的患者少許皮下脂肪組織中分離培養(yǎng)得人脂肪源間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs),繼而誘導分化為成熟的人脂肪細胞。采用流式細胞術及油紅O染色法鑒定脂肪細胞。構建含人apoO-siRNA的慢病毒表達載體并包

5、裝好后,以低濃度氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-densitylipoprotein,ox-LDL)(12.5μg/ml)分別干預正常人脂肪細胞或轉染了apoO-siRNA慢病毒顆粒的脂肪細胞,采用real-time PCR檢測apoO、白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、單核趨化蛋白-1(monocytechemoattractant protein-1,MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor n

6、ecrosisfactor-α,TNF-α)mRNA水平;western blot法檢測apoO蛋白表達;ELISA法檢測細胞上清液炎性細胞因子IL-6、MCP-1、TNF-α蛋白水平。
  二.載脂蛋白O調節(jié)脂肪細胞分泌功能的可能作用機制
  人ADSCs以促分化液促分化14天,或于促分化第4天行慢病毒轉染沉默apoO表達并繼續(xù)誘導分化成熟后,以低濃度ox-LDL(12.5μg/ml)分別干預上述兩種脂肪細胞,real-t

7、ime PCR檢測Toll樣受體4(Toll-like receptor4,TLR4)、髓樣分化因子88(myeloid differentiationprimary response protein88,MyD88)、白介素-1受體相關激酶4(IL-1receptor-associated kinase4,IARK4)、腫瘤壞死因子受體相關因子6(TNF receptor associated factor6,TRAF6)mRNA水平

8、變化;westernblot法檢測TLR4、核因子κB抑制蛋白α(inhibitor of nuclearfactor-κB-α, IκBα)及磷酸化IκBα(phosphorylated IκBα,Phospho-IκBα)的表達情況。
  三.載脂蛋白O調控TLR4/NF-κB信號通路方式的探討
  促分化成熟的人脂肪細胞用低濃度 ox-LDL(12.5μg/ml)干預24小時,對比觀察刺激前后如下情況:①免疫熒光法觀察

9、apoO在脂肪細胞內的定位;激光共聚焦檢測細胞內apoO與caveolin-1的分布關系;②蔗糖密度梯度離心法處理細胞,觀察apoO在小凹區(qū)域的分布;③免疫共沉淀法檢測apoO與caveolin-1是否存在互相作用。另于誘導分化第4天行慢病毒轉染沉默細胞內apoO表達并繼續(xù)誘導分化至成熟后,檢測細胞內膽固醇含量變化。
  結果:
  一.載脂蛋白O對人脂肪細胞分泌功能的影響
  1.成功提取人脂肪源間充質干細胞并誘導分

10、化為成熟的人脂肪細胞;
  2.構建的apoO-siRNA慢病毒顆粒能有效抑制人脂肪細胞中apoO mRNA及蛋白的表達(P<0.005);
  3.與對照組相比,低濃度ox-LDL刺激后,人脂肪細胞內apoO表達增加并伴促炎細胞因子IL-6、MCP-1、TNF-αt合成減少(P<0.01);
  4.有效沉默細胞內apoO表達后,低濃度ox-LDL刺激可明顯增加IL-6、MCP-1、TNF-α等促炎細胞因子的合成與分

11、泌(P<0.01)。
  二.載脂蛋白O調節(jié)脂肪細胞分泌功能的可能作用機制
  1.與對照組相比,低濃度ox-LDL刺激后,人脂肪細胞內TLR4表達無顯著變化(P>0.05);
  2.低濃度ox-LDL刺激人脂肪細胞可明顯抑制TLR4/NF-κB信號通路活性(P<0.05);
  3.有效沉默細胞內apoO表達后,低濃度ox-LDL刺激可激活TLR4/NF-κB信號通路(P<0.05)。
  三.載脂蛋白

12、O調控TLR4/NF-κB信號通路方式的探討
  1.基礎狀態(tài)下,人脂肪細胞內apoO定位于胞漿脂滴膜上;低濃度ox-LDL刺激后,apoO可移至胞膜小凹區(qū)域與caveolin-1共定位;
  2.免疫共沉淀檢測發(fā)現(xiàn),apoO與caveolin-1可發(fā)生相互作用;
  3.有效沉默apoO表達后,脂肪細胞內膽固醇含量無明顯變化(P>0.05)。
  結論:
  1.內源性apoO介導了低濃度ox-LDL對脂

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