葡糖對載脂蛋白M代謝的影響和機制研究.pdf

1、載脂蛋白M(apoM)是1999年由瑞典隆德大學的Xu和Dahlback首先發(fā)現(xiàn)和分離的一種新型人類載脂蛋白，主要存在于血漿高密度脂蛋白HDL中。ApoM通過影響前β-HDL的形成調節(jié)膽固醇的出胞，是HDL代謝的重要調節(jié)因子，可能具有抗動脈粥樣硬化的保護作用。ApoM的表達和分泌受多種因子的調節(jié)，與冠心病、糖尿病以及其他脂質代謝紊亂的疾病關系密切。糖尿病人患者血漿apoM水平明顯下降。漢族人群中apoM基因近端啟動子單核苷酸多態(tài)性T-7

2、78C與血漿膽固醇和空腹血糖相關，并可能增加罹患2型糖尿病的風險。糖尿病小鼠肝臟和血清apoM均顯著下降，外源性的胰島素可部分逆轉這一趨勢。細胞實驗發(fā)現(xiàn)胰島素、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor I，IGF-I)和IGF-1功能肽(IGF-I potential peptide，IGF-IPP)可明顯抑制人類肝癌細胞株apoM mRNA的表達，且呈時間和劑量依賴性。但這種體內和體外實驗結果不一致的原

3、因尚不清楚。實驗發(fā)現(xiàn)高糖本身則具有抑制載脂蛋白M的表達和分泌的作用，但具體機制不明。研究發(fā)現(xiàn)高血糖可激活體內氨基己糖途徑，導致內源性葡糖胺生成增加，糖基化代謝產物增多。氨基己糖代謝通路是糖酵解的一大分支，我們推測高糖抑制apoM的表達和分泌是否是通過氨基己糖途徑來是實現(xiàn)的，而葡糖胺是模擬體內氨基己糖代謝通路最常用的物質，所以研究葡糖胺對apoM代謝的影響有助于了解高糖抑制apoM表達的原因。
　　 葡糖胺是構成體內粘多糖和殼質的

4、一種含氨基單糖，通過糖代謝的重要分支氨基己糖途徑進行代謝，具有重要的生理功能。臨床試驗發(fā)現(xiàn)常規(guī)劑量的葡糖胺對體內糖代謝穩(wěn)態(tài)無明顯影響，但各種病理條件下氨基己糖代謝通路過度激活后會引起一系列基因表達的改變，導致葡萄糖利用障礙和胰島素抵抗，引起糖代謝和脂蛋白代謝的變化。但其他研究發(fā)現(xiàn)，葡糖胺可明顯減輕高血糖對血管的損傷，并具有調節(jié)脂蛋白基因表達和蛋白合成的作用。葡糖胺通過內質網應激強化載脂蛋白B-100共翻譯期的蛋白酶水解作用和翻譯后的非蛋

5、白酶降解作用而特異性地減少載脂蛋白B-100的分泌。葡糖胺通過延長載脂蛋白AlmRNA的半衰期，促進其基因表達和蛋白分泌。葡糖胺對apoM的影響目前尚不清楚，研究兩者之間的聯(lián)系有助于更好地了解氨基己糖途徑對體內脂蛋白代謝以及動脈粥樣硬化過程的影響，使其成為臨床治療糖尿病、肥胖癥、高胰島素血癥和其他脂質代謝異常的疾病的新靶點。
　　 第一部分葡糖胺對人肝癌細胞株載脂蛋白M基因表達的影響
　　 目的：研究葡糖胺在體外對人肝癌

6、細胞株HepG2細胞apoM和apoA1mRNA表達的影響。
　　 方法：通過在人肝癌細胞株HepG2細胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的葡糖胺(0、1 mmol/L和5 mmol/L)孵育24小時后提取細胞，實時定量PCR法檢測apoM和apoA1mRNA的表達水平。
　　 結果：細胞實驗發(fā)現(xiàn)各組apoM mRNA和apoA1 mRNA水平有差異。1mol/L葡糖胺組apoM mRNA水平較對照組增加60％(P<0.05)，而5

7、mol/L組apoMmRNA增加47.7％(P>0.05)。1mol/L和5mol/L組apoA1 mRNA較對照組分別增加1.03倍(P>0.05)和2.59倍(P<0.05)。
　　 結論：葡糖胺可促進人肝癌細胞株HepG2細胞apoM和apoA1的基因表達。
　　 第二部分葡糖胺對健康SD大鼠載脂蛋白M表達和分泌的影響
　　 目的：了解外源性葡糖胺對健康成年SD大鼠apoM表達和分泌的影響。
　　

8、方法：采用健康成年SD大鼠尾靜脈置管，使用微量注射泵以2.5ml/h速度連續(xù)6小時泵入不同濃度的葡糖胺(1 mmol/L和10 mmol/L)，對照組以同樣方法泵入生理鹽水，Western-blot法檢測大鼠血清apoM的濃度變化，RT-PCR法檢測apoMmRNA的水平，同時檢測血糖、胰島素、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、膽固醇、甘油三酯和脂蛋白a的變化。
　　 結果：動物實驗發(fā)現(xiàn)SD大鼠尾靜脈連續(xù)灌注葡糖胺6小時后，肝臟apo

9、M mRNA水平有明顯差異(H=7.344，P=0.0254)。1mmol/L葡糖胺組較生理鹽水對照組肝臟apoMmRNA水平升高9.6％(P>0.05)，而10mmol/L葡糖胺組升高3.40倍(P<0.05)。血清apoM蛋白水平僅輕度增加，差異無統(tǒng)計學意義(H=0.98，P=0.6126)。同時10mmol/L葡糖胺組HDL水平較對照組顯著升高20.3％，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而甘油三酯、脂蛋白a和低密度脂蛋白無明顯變

10、化。
　　 結論：葡糖胺促進健康成年SD大鼠肝臟apoMmRNA的表達，血清apoM蛋白水平也輕度增加。短時間的高葡糖胺狀態(tài)對血清甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白和Lp(a)影響不大，但高密度脂蛋白明顯升高，提示葡糖胺可能具有促進HDL合成的作用，與apoM的變化趨勢相一致。
　　 第三部分葡糖胺調節(jié)載脂蛋白M表達和分泌的機制研究
　　 目的：通過加入氨基己糖代謝途徑關鍵限速酶GFAT的抑制劑azaserine，

11、了解氨基己糖代謝通路對載脂蛋白M的影響。同時通過分別加入葡糖胺或胰島素，了解葡糖胺調節(jié)apoM的具體調節(jié)機制。
　　 方法：①A組為對照組，B組加入5umol/Lazaserine，C組加入5umol/Lazaserine+10mmol/L葡糖胺，培養(yǎng)24小時后提取細胞，實時定量PCR法檢測apoMmRNA的表達水平。②A組為對照組，B組加入5mmol/L葡糖胺，C組加入5mmol/L葡糖胺+1ug/ml胰島素，培養(yǎng)24小時后提

12、取細胞，實時定量PCR法檢測apoM和apoA1 mRNA的表達水平。③A組為對照組，B組加入20umol/L azaserine，C組加入1ug/ml胰島素+20umol/L azaserine，D組加入5mmol/L葡糖胺+1ug/ml胰島素+20umol/L azaserine，培養(yǎng)24小時后提取細胞，實時定量PCR法檢測apoM和apoA1 mRNA的表達水平。
　　 結果：①培養(yǎng)基中加入5umol/L azaserin

13、e后apoM mRNA水平較對照組下降35.4％(P<0.05)，而外源性葡糖胺則可逆轉這一趨勢，使apoM mRNA恢復至對照組水平。②單純5mmol/L葡糖胺可使人肝癌細胞株HepG2細胞apoM mRNA水平較對照組顯著升高51.1％(P<0.05)，而5mmol/L葡糖胺+1ug/ml胰島素組apoM mRNA水平較對照組升高78.2％(P<0.01)。③葡糖胺+胰島素+azaserine組apoMmRNA水平較單純azaser

14、ine組升高120％(P<0.05)，較胰島素+azaserine組升高68.9％(P<0.05)。葡糖胺+胰島素+azaserine組apoA1 mRNA水平較單純azaserine組升高3.6倍(P<0.01)，較胰島素+azaserine組升高1.85倍(P<0.01)。
　　 結論：葡糖胺通過氨基己糖通路調節(jié)apoM的基因表達，而且內源性和外源性氨基己糖對apoM的生成同樣重要。胰島素可顯著加強葡糖胺對apoM表達的促進