ETS和C-EBP對(duì)載脂蛋白F轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、目的：載脂蛋白F（apolipoprotein F，ApoF）是近些年發(fā)現(xiàn)的載脂蛋白，其血漿濃度與血脂異常密切相關(guān)，本課題主要是深入研究ETS和C/EBP調(diào)控載脂蛋白F基因表達(dá)的機(jī)制。
　　方法：1.將ApoF啟動(dòng)子區(qū)構(gòu)建在PGL4載體上，2.通過pumbed基因數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)本課題先前已預(yù)測(cè)的潛在轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)框，并通過基因合成的方法構(gòu)建相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)克隆3.啟動(dòng)子分別與轉(zhuǎn)錄因子及其相應(yīng)顯性失活突變體共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)4.電泳遷移率檢測(cè)和

2、染色質(zhì)免疫共沉淀從體內(nèi)外驗(yàn)證反式作用因子和順式作用元件的直接相互作用5.通過westernblot及realtime PCR檢測(cè)人類不同組織來源細(xì)胞株的ApoF蛋白及mRNA表達(dá)水平6.通過westernblot檢測(cè)人類不同組織來源細(xì)胞株的C/EBPα、C/EBPβ蛋白表達(dá)水平7.轉(zhuǎn)錄因子特異性siRNA實(shí)驗(yàn)8.從蛋白水平檢測(cè) ETS-1、ETS-2、C/EBPα、ETS-1與 C/EBPα、ETS-2與C/EBPα對(duì)ApoF是否具有促

3、進(jìn)作用9.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用。
　　結(jié)果：1.成功構(gòu)建PGL4-ApoF198熒光報(bào)告基因2.將C/EBP及HNF3家族成功構(gòu)建在pcDNA3.1表達(dá)載體上3.發(fā)現(xiàn)ApoF的蛋白和mRNA表達(dá)水平在肝組織來源的細(xì)胞株特別高4.發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα、C/E BPβ、ETS-1蛋白表達(dá)水平在肝組織來源的細(xì)胞株特別高5.過表達(dá)HNF3對(duì)ApoF啟動(dòng)子無明顯激活作用6.過表達(dá)C/EBP能夠明顯增加ApoF的啟動(dòng)子

4、活性,過表達(dá) C/EBP顯性失活突變體抑制ApoF啟動(dòng)子的活性7.特異性C/EBPsiRNA能夠明顯抑制ApoF的啟動(dòng)子活性8.ETS-1、ETS-2、C/EBPα、ETS-1與 C/EBPα、ETS-2與C/EBPα對(duì)ApoF是具有促進(jìn)作用，且ETS1與C/EBPα對(duì)ApoF具有協(xié)同作用。9.ETS-1可以把C/EBPα沉淀下來，且C/EBPa也能沉淀ETS-1下來。
　　結(jié)論：1.C/EBPα轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合ApoF的啟動(dòng)子，