載脂蛋白M與肥胖代謝異常及其干預(yù)探討.pdf

1、背景:
　　 大量研究顯示,高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平和冠心病的發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)。提高HDL-C水平可延緩或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。HDL-C抗動(dòng)脈粥樣硬化主要與HDL-C在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)中發(fā)揮的關(guān)鍵作用有關(guān)。隨著生活環(huán)境和膳食結(jié)構(gòu)的改變,肥胖病發(fā)生率在全球范圍內(nèi)呈迅速上升趨勢(shì),肥胖是引起HDL-C降低的常見(jiàn)疾病。他汀類(lèi)和貝特類(lèi)藥物是目前臨床上常見(jiàn)的調(diào)脂藥,研究表明他汀類(lèi)和貝特類(lèi)藥物能不同程度的升高HDL-C水

2、平和改善RCT。
　　 載脂蛋白M(apoM)是新近發(fā)現(xiàn)的一種主要與HDL-C相關(guān)的載脂蛋白,對(duì)HDL-C的代謝起重要作用,它主要通過(guò)對(duì)前β-HDL生成的調(diào)節(jié)來(lái)影響人體RCT過(guò)程。apoM在HDL—C生成和RCT過(guò)程中不可替代。肝細(xì)胞核因子-1α(HNF-1α),叉頭轉(zhuǎn)錄因子A2(FoxA2)和肝X受體α(LXRα)是調(diào)節(jié)apoM表達(dá)的三個(gè)關(guān)鍵核受體。其中,前兩者上調(diào)apoM的表達(dá),后者F調(diào)apoM的表達(dá)。
　　 目前尚

3、不清楚他汀類(lèi)和貝特類(lèi)藥物升高HDL-C和改善RCT是否與apoM有關(guān)；也不知肥胖狀態(tài)下低HDL-C血癥是否與apoM有關(guān)。研究證實(shí)肥胖是慢性炎癥性疾病,且常伴隨低脂聯(lián)素血癥,目前尚無(wú)肥胖狀態(tài)下apoM與炎癥因子和脂聯(lián)素的關(guān)系研究。
　　 目的:
　　 觀察肥胖小鼠載脂蛋白M的改變,并探討肥胖狀態(tài)下載脂蛋白M與脂聯(lián)素的關(guān)系,并揭示其機(jī)制；觀察肥胖患者載脂蛋白M水平并探討其與炎癥因子的關(guān)系；探討辛伐他汀和非諾貝特及兩者聯(lián)合對(duì)

4、載脂蛋白M表達(dá)的影響及其機(jī)制。
　　 方法;
　　 一、肥胖小鼠載脂蛋白M的改變及與脂聯(lián)素關(guān)系的探討
　　 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　 32只3周齡雄性C57BL/6 N小鼠,隨機(jī)分為4組(n=8/組):(1)對(duì)照組:普通飲食,喂養(yǎng)12周；(2)肥胖組:高脂飼料,喂養(yǎng)12周；(3)肥胖干預(yù)組:高脂飼料,喂養(yǎng)12周后脂聯(lián)素干預(yù)7天。(4)普通干預(yù)組:普通飲食,喂養(yǎng)12周后脂聯(lián)素干預(yù)7天。分別于實(shí)驗(yàn)第0周、第12周及

5、脂聯(lián)素干預(yù)后測(cè)定體重,血漿脂聯(lián)素,血糖,血漿胰島素。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),取小鼠內(nèi)臟脂肪并稱取重量,取小鼠肝臟組織標(biāo)本,采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(實(shí)時(shí)RT-PCR)和免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)小鼠肝臟載脂蛋M、FoxA2的mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　 2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　 高濃度胰島素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞構(gòu)建胰島素抵抗(IR)肝細(xì)胞模型,采用實(shí)時(shí)RT-PCR和Western Blot檢測(cè)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下肝細(xì)胞的ap

6、oM基因和蛋白表達(dá)變化。脂聯(lián)素分別干預(yù)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞、HepG2細(xì)胞24h,采用實(shí)時(shí)RT-PCR和Westem Blot檢測(cè)各組細(xì)胞載脂蛋白M、FoxA2的mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　 二、肥胖患者載脂蛋白M水平及其與炎癥因子的關(guān)系研究
　　 入選58例健康者和40例肥胖患者作為研究對(duì)象,常規(guī)測(cè)量血壓、體重、身高,計(jì)算體重指數(shù),抽取空腹靜脈血檢測(cè)其血糖、血脂、空腹胰島素、血漿apoM、白細(xì)胞介素-6(IL-6)

7、、高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血漿脂聯(lián)素,并檢測(cè)肱動(dòng)脈內(nèi)皮舒張功能(FMD)。
　　 三、辛伐他汀和非諾貝特對(duì)載脂蛋白M表達(dá)的影響及調(diào)控機(jī)制
　　 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　 32只8周齡健康雄性C57BL/6N小鼠,隨機(jī)分為四組:(1)對(duì)照組:正常普通飲食喂養(yǎng)；(2)他汀組:辛伐他汀干預(yù)4周；(3)貝特組:非諾貝特干預(yù)4周；(4)聯(lián)合組:辛伐他汀和非諾貝特干預(yù)4周；分別在實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)4

8、周測(cè)定空腹血脂水平。4周后取動(dòng)物肝臟組織標(biāo)本,采用實(shí)時(shí)RT-PCR和免疫印跡測(cè)定肝臟apoM的基因和蛋白表達(dá),同時(shí)采用實(shí)時(shí)RT-PCR和Western Blot測(cè)定肝臟HNF-1α和LXRα的基因和蛋白表達(dá)。
　　 2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　 分別以不同濃度的辛伐他汀和非諾貝特及辛伐他汀+非諾貝特、辛伐他汀+HNF-1α抑制劑、辛伐他汀+LXRα激動(dòng)劑、非諾貝特+HNF-1α抑制劑、非諾貝特+LXRα抑制劑干預(yù)HepG2細(xì)胞24

9、 h。提取各組細(xì)胞總RNA和蛋白質(zhì),分別采用實(shí)時(shí)RT-PCR和Western Blot檢測(cè)apoM的mRNA和蛋白的表達(dá)。采用實(shí)時(shí)RT-PCR和Western Blot檢測(cè)HNF-1α和LXRα的基因和蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 一、肥胖小鼠載脂蛋白M的改變及與脂聯(lián)素關(guān)系的探討
　　 1.與對(duì)照組比較,肥胖組、肥胖干預(yù)組小鼠體重顯著高于對(duì)照組,肥胖組的內(nèi)臟脂肪重量、空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數(shù)顯著高于

10、對(duì)照組；與對(duì)照組比較,肥胖組血漿脂聯(lián)素水平顯著下降；肥胖干預(yù)組血糖、血漿胰島素、胰島素抵抗指數(shù)顯著低于肥胖組,肥胖干預(yù)組血漿脂聯(lián)素水平顯著高于肥胖組,肥胖干預(yù)組內(nèi)臟脂肪重量與肥胖組比較尤統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2.與對(duì)照組比較,肥胖組肝臟載脂蛋白M的mRNA和蛋白表達(dá)顯著下降。
　　 3.與對(duì)照組比較,肥胖組肝臟FoxA2的mRNA和蛋白表達(dá)顯著下降。
　　 4.脂聯(lián)素干預(yù)后的肥胖干預(yù)組小鼠載脂蛋白M的mRNA和蛋白

11、表達(dá)顯著高于肥胖組,脂聯(lián)素作用于普通干預(yù)組小鼠載脂蛋白M的mRNA和蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 5.脂聯(lián)素干預(yù)后的肥胖干預(yù)組小鼠FoxA2的mRNA和蛋白表達(dá),血漿脂聯(lián)素水平顯著高于肥胖組；空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR均顯著低于肥胖組。脂聯(lián)素作用于普通干預(yù)組小鼠FoxA2的mRNA和蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 6.胰島素抵抗HepG2細(xì)胞較HepG2細(xì)胞載脂蛋白M、FoxA2的mRNA

12、和蛋白表達(dá)均顯著下降。
　　 7.脂聯(lián)素干預(yù)后,胰島素抵抗HepG2細(xì)胞載脂蛋白M、FoxA2的mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加。
　　 8.脂聯(lián)素干預(yù)后HepG2細(xì)胞載脂蛋白M、FoxA2的mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化。
　　 二、肥胖患者載脂蛋白M水平及其與炎癥因子的關(guān)系研究
　　 1.與對(duì)照組比較,肥胖患行的血漿apoM、HDL-C、血漿脂聯(lián)素、FMD水平顯著降低,空腹胰島素、IL-6、TNF-α、hs-

13、CRP水平升高。
　　 2.肥胖患者血漿apoM與HDL-C顯著正相關(guān),血漿apoM與BMI、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、IL-6、TNF-α、CRP水平顯著負(fù)年相關(guān),血漿apoM與血漿脂聯(lián)素、LDL-C、TC、TG、血壓、血糖、FMD無(wú)顯著相關(guān)。對(duì)照組apoM與HDL-C顯著正相關(guān),血漿apoM與BMI顯著負(fù)相關(guān),血漿apoM與胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、IL-6、TNF-α、CRP血漿脂聯(lián)素、LDL-C、TC、TG、血壓、血糖、FM

14、D均無(wú)顯著相關(guān)。
　　 三、辛伐他汀和非諾貝特對(duì)載脂蛋白M表達(dá)的影響及調(diào)控機(jī)制
　　 1.與對(duì)照組比較,藥物治療組HDL-C均顯著升高,聯(lián)合組升高程度高于他汀組和貝特組；藥物治療組apoM的基因和蛋白均顯著升高,聯(lián)合組升高程度高于他汀組和貝特組；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示,辛伐他汀和非諾貝特均呈劑量依賴性上調(diào)apoM的表達(dá),聯(lián)合組升高程度高于他汀組和貝特組。辛伐他汀+HNF-1α抑制劑組、辛伐他汀+LXRα激動(dòng)劑組apoM的基因和蛋白

15、水平均顯著低于同濃度辛伐他汀組；非諾貝特+HNF-1α抑制劑組apoM的基因和蛋白水平均顯著低于同濃度非諾貝特組,非諾貝特+LXRα抑制劑組apoM的基因和蛋白水平均顯著高于同濃度非諾貝特組。
　　 2.與對(duì)照組比較,藥物治療組HNF-1α的基因和蛋白均顯著升高,聯(lián)合組升高程度高于他汀組和貝特組；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示,辛伐他汀和非諾貝特均呈劑量依賴性上調(diào)HNF-1α的基因和蛋白表達(dá),聯(lián)合組升高程度高于他汀組和貝特組。
　　 3.

16、他汀組LXRα的基因和蛋白表達(dá)顯著降低,貝特組LXRα的基因和蛋白表達(dá)顯著升高,聯(lián)合組LXRα的基因和蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示,辛伐他汀呈劑量依賴性下調(diào)LXRα的基因和蛋白表達(dá),非諾貝特呈劑量依賴性上調(diào)LxRα的基因和蛋白表達(dá),聯(lián)合組LXRα的基因和蛋白表達(dá)與對(duì)照組無(wú)顯著差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.肥胖小鼠載脂蛋白M、FOXA2基因和蛋白表達(dá)明顯下降,載脂蛋白M下降可能與FOXA2表達(dá)降低有關(guān)。<

17、br>　　 2.肥胖小鼠血漿脂聯(lián)素水平顯著下降,內(nèi)臟脂肪重量、空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR顯著增加。
　　 3.脂聯(lián)素可上調(diào)肥胖小鼠載脂蛋白M表達(dá),其機(jī)制可能與脂聯(lián)素改善胰島素抵抗,進(jìn)而上調(diào)FOXA2表達(dá)有關(guān)。
　　 4.脂聯(lián)素可上調(diào)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞載脂蛋白M表達(dá),卻對(duì)HepG2細(xì)胞載脂蛋白M表達(dá)無(wú)影響,這提示脂聯(lián)素對(duì)載脂蛋白M的調(diào)控可能是間接通過(guò)影響胰島素抵抗來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　 5.肥胖患者血漿

18、apoM顯著降低,apoM水平降低可能是肥胖患者HDL-C下降的潛在機(jī)制之一。
　　 6.肥胖患者apoM水平與hs-CRP、TNF-α、IL-6水平密切相關(guān),apoM可能受到這些炎癥因子的調(diào)控,其機(jī)制可能與炎癥因子促進(jìn)胰島素抵抗有關(guān)。
　　 7.肥胖患者apoM水平與FMD無(wú)顯著相關(guān),提示apoM還不能作為早期動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)測(cè)因子。
　　 8.辛伐他汀和非諾貝特升高HDL-C可能與上調(diào)apoM表達(dá)有關(guān),兩者聯(lián)合