載脂蛋白E及其基因多態(tài)性對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧性損傷的影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、載脂蛋白E（Apolipoprotein E，APOE表示其基因，apoE表示其編碼蛋白）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的載脂蛋白，主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。近年來(lái)，APOE基因多態(tài)性在腦損傷后繼發(fā)性病理生理改變以及傷后轉(zhuǎn)歸中的作用越來(lái)越被更多的國(guó)內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注，普遍認(rèn)為攜帶APOEε4等位基因的患者腦損傷易損性增加，并且可導(dǎo)致不良預(yù)后，但是相關(guān)機(jī)制目前仍不甚明了。
　　缺氧是引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞損傷最常見(jiàn)的原因，是腦創(chuàng)傷、缺血性卒中等疾病的

2、基本病理過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧后釋放的多種細(xì)胞毒性介質(zhì)對(duì)周?chē)窠?jīng)元可產(chǎn)生明顯的損傷。越來(lái)越多的研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變?cè)谥T多疾病，如腦水腫、炎性脫髓鞘疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病等發(fā)病機(jī)制中扮演了重要的角色。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的細(xì)胞。然而目前對(duì)神經(jīng)保護(hù)的研究主要集中于對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)，對(duì)其他非神經(jīng)元細(xì)胞如星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)研究卻少見(jiàn)報(bào)道。本課題以星形膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象，模擬腦損傷后腦組織缺血缺氧這

3、一病理生理改變，探討了apoE在此過(guò)程中的作用。本課題主要包括以下四方面的研究:
　　一、星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)及缺氧損傷模型的建立.
　　采用酶消化法原代培養(yǎng)APOE基因敲除(APOE KO)鼠、APOE基因野生(APOE WT)鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞、并純化鑒定;參照相關(guān)文獻(xiàn)，予細(xì)胞缺氧6h，構(gòu)建星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧損傷模型，透射電鏡觀(guān)察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)變化。結(jié)果:光鏡顯示，細(xì)胞呈“鋪路石”樣排列，胞體較大呈不規(guī)則形，細(xì)胞免疫熒光

4、發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞能被抗GFAP的抗體識(shí)別;缺氧6h后，通過(guò)電鏡均觀(guān)察到細(xì)胞足突腫脹，線(xiàn)粒體形態(tài)不規(guī)則，空泡化，嵴不規(guī)則，可見(jiàn)細(xì)胞核凝集，染色質(zhì)固縮、以及凋亡小體等凋亡細(xì)胞明顯特征。結(jié)論:本部分實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了細(xì)胞的缺氧損傷模型，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　二、apoE對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧性損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究。
　　1.將培養(yǎng)成熟的APOE KO及APOE WT星形膠質(zhì)細(xì)胞均分為常氧組、缺氧組、常氧+T0901317組、缺氧+T0

5、901317組，后兩組細(xì)胞均為在常氧/缺氧前48h，向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入促進(jìn)apoE蛋白表達(dá)增加的肝X受體(liver X receptor，LXR)激動(dòng)劑T0901317，并使其在培養(yǎng)基中的濃度為300 nM。流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)以上各組細(xì)胞凋亡率情況。2.將培養(yǎng)成熟的APOE KO星形膠質(zhì)細(xì)胞按照向其培養(yǎng)基中加入外源性apoE3的濃度分成6組:空白組、100 nM組、300 nM組、1000 nM組、2000 nM組、3000 nM組，

6、apoE3于缺氧前30min加入，予各組細(xì)胞缺氧6h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率情況。3.將培養(yǎng)成熟的APOEKO及APOE WT星形膠質(zhì)細(xì)胞均分為常氧組、缺氧組、常氧+T0901317組、缺氧+T0901317組，后兩組細(xì)胞均為在常氧/缺氧前48h，向細(xì)胞培養(yǎng)基中T0901317，并使其在培養(yǎng)基中的濃度為300 nM。缺氧6h后，收集各組細(xì)胞的細(xì)胞外液，通過(guò)氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)各組細(xì)胞外液中谷氨酸的水平。4.將培養(yǎng)成熟的APOE

7、KO星形膠質(zhì)細(xì)胞分為常氧組、缺氧組、缺氧+apoE3組、缺氧+MK801組、缺氧+apoE3+MK801組，后3組在缺氧前30min分別向培養(yǎng)基中加入人重組apoE3（1μM）、NMDA受體拮抗劑MK801（10μM）、apoE3（1μM）+MK801（10μM），流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)以上各組細(xì)胞凋亡率。5.將培養(yǎng)成熟的APOE KO及APOE WT星形膠質(zhì)細(xì)胞均分為對(duì)照組、谷氨酸組、對(duì)照+T0901317組、谷氨酸+T0901317組，

8、谷氨酸組為向培養(yǎng)基中加入谷氨酸(50mM)，對(duì)照組即不作任何處理，保持原培養(yǎng)條件不變，后兩組為在未加入/加入谷氨酸前48h，向培養(yǎng)基中加入LXR激動(dòng)劑T0901317(300 nM);以上各組予繼續(xù)培養(yǎng)24h;流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)以上各組細(xì)胞凋亡率。結(jié)果:1.缺氧6h后，APOE KO缺氧組細(xì)胞凋亡率明顯高于A(yíng)POEWT缺氧組(p＜0.05);T0901317能明顯降低APOE WT缺氧組細(xì)胞凋亡率(p＜0.05)，但是對(duì)APOE KO缺

9、氧組無(wú)明顯作用(p＞0.05)。2.從300 nM組開(kāi)始，細(xì)胞凋亡率較空白組明顯降低（p＜0.05），1000 nM組細(xì)胞凋亡率最低。3.缺氧后6h，APOE KO組、APOE WT組細(xì)胞外液中谷氨酸濃度較常氧組明顯增加（p＜0.05），且APOE KO缺氧組明顯高于A(yíng)POEWT缺氧組(p＜0.05); T0901317能明顯降低APOE WT缺氧組細(xì)胞外液中谷氨酸濃度（p＜0.05），但是對(duì)APOE KO缺氧組無(wú)明顯作用(p＞0.05

10、)。4.與常氧組相比，缺氧組、缺氧+apoE3組、缺氧+MK801組、缺氧+apoE3+MK801組細(xì)胞凋亡率均明顯增加（p＜0.05），外源性加入apoE3或（和）MK801后，細(xì)胞凋亡率較單純?nèi)毖踅M明顯降低（p＜0.05），但是apoE3、MK801對(duì)細(xì)胞缺氧性損傷的保護(hù)作用相似，且兩者作用不疊加。5.谷氨酸處理24h后，APOE KO組、APOE WT組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯增加（p＜0.05），且APOE KO缺氧組明顯高于A(yíng)P

11、OE WT缺氧組(p＜0.05);T0901317能明顯降低APOE WT谷氨酸組細(xì)胞凋亡率(p＜0.05)，但是對(duì)APOE KO谷氨酸組無(wú)明顯作用(p＞0.05)。結(jié)論:apoE對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧性損傷具有保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用具有劑量-反應(yīng)關(guān)系。apoE可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧后NMDA受體的過(guò)度激活，降低谷氨酸的毒性，增加星形膠質(zhì)細(xì)胞apoE的表達(dá)可能是缺氧性神經(jīng)損傷保護(hù)的一種新途徑。
　　三、apoE在星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧性損

12、傷中的表達(dá)變化及其機(jī)制。
　　將培養(yǎng)成熟的APOE WT鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞分為常氧組、缺氧組和干預(yù)組（缺氧+ERK抑制劑），分別予缺氧組和干預(yù)組缺氧6h，干預(yù)組在缺氧之前向培養(yǎng)基中加入ERK信號(hào)通路抑制劑U0126，Westernblot法分別檢測(cè)檢測(cè)三組細(xì)胞apoE蛋白表達(dá)變化情況。結(jié)果:與常氧組和干預(yù)組相比，缺氧組星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的apoE蛋白明顯增加(p＜0.05)。結(jié)論:缺氧使星形膠質(zhì)細(xì)胞apoE蛋白水平表達(dá)上調(diào)，ERK信號(hào)

13、通路參與了該調(diào)節(jié)過(guò)程。
　　四、 APOE基因多態(tài)性在星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧性損傷過(guò)程中的作用。
　　1.原代培養(yǎng)APOE WT鼠、APOE轉(zhuǎn)基因鼠(ε3、ε4)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，純化鑒定，并構(gòu)建6h細(xì)胞缺氧損傷模型;2.采用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率及線(xiàn)粒體膜電位變化情況。結(jié)果:APOEε4組細(xì)胞早期凋亡率、線(xiàn)粒體膜電位下降程度明顯高于A(yíng)POEε3、APOE野生鼠組（P＜0.05）。結(jié)論:缺氧損傷后早期，與APOEε3、AP