近江牡蠣天然免疫相關(guān)蛋白的分子生物學(xué)及功能研究.pdf

1、牡蠣等無脊椎動物的天然免疫相關(guān)蛋白及其與病原的相互作用是國際病害與分子免疫學(xué)研究的熱點問題。類立克次體是一類專性細胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性細菌,可引起牡蠣的大規(guī)模死亡,但目前在貝類抗RLO感染機理方面所知甚少。本博士學(xué)位論文在對近江牡蠣天然免疫相關(guān)蛋白的基因(sTRAIL,Tolloid-like,MAK3和p38)和/或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子生物學(xué)進行研究的基礎(chǔ)上,對它們的功能進行了研究,即:一方面采用類立克次體對近江牡蠣宿主進行誘導(dǎo)刺激,系統(tǒng)

2、地分析了宿主與類立克次體病原的相互作用:即牡蠣sTRAIL,Tolloid-like,MAK3和p38在類立克次體誘導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)中的功能、作用機制,以及sTRAIL在免疫反應(yīng)中的信號傳導(dǎo)通路。另一方面本研究系統(tǒng)地探索研究了sTRAIL對牡蠣正常血淋巴細胞和腫瘤細胞的細胞毒作用及其作用機制和信號傳導(dǎo)通路。一、關(guān)于近江牡蠣sTRAIL促細胞凋亡及抗類立克次體感染免疫的研究
　　 取近江牡蠣血淋巴細胞,采用TRIzol法提取總RN

3、A,制備cDNA模板。根據(jù)人和不同動物TRAIL基因序列設(shè)計引物,采用RT-PCR技術(shù)首次在雙殼貝類中獲得了CaSTRAIL的編碼序列。該cDNA序列含有一個501 bp的讀碼框,編碼一個18.4kDa的蛋白,該蛋白含有一個典型的TNF結(jié)構(gòu)域。CasTRAIL與人的TRAIL基因同源性較高,兩者的cDNA序列同源性為99％,氨基酸序列的同源性為98％；與草魚的同源性則較低,為42％。各組織原位雜交和RT-PCR結(jié)果表明:CasTRAIL

4、在牡蠣各正常組織中均有表達,在外套膜、血淋巴和鰓中表達量較高,性腺中表達量很低,提示該基因可能與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。通過構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-CasTRAIL,在大腸桿菌中對CasTRAIL進行了誘導(dǎo)表達,并純化蛋白制備了多克隆抗體；同時,利用該抗體對牡蠣TRAIL的亞細胞定位進行了研究:結(jié)果表明CasTRAIL在大腸桿菌中得到了高效表達,所制備的兔多克隆抗體的效價為1:4000；牡蠣TRAIL蛋白主要表達于血淋巴細胞的細胞膜上,是一個跨膜

5、蛋白。隨后利用Real time RT-PCR、流式細胞儀、DNA電泳、Western blotting和抗體技術(shù)等探索研究了CasTRAIL對牡蠣正常血淋巴細胞和腫瘤細胞的細胞毒作用及其作用機制和信號傳導(dǎo)通路。結(jié)果證明:CasTRAIL可通過激活死亡受體(DR4和DRS)途徑引起人類腫瘤細胞HL-60的凋亡；對正常牡蠣血淋巴紐胞無毒性,但可引起p38和ERK等磷酸化水平的提高,表明MAPKs與CasTRAIL信號傳導(dǎo)的和功能有關(guān)。接著

6、,利用原位雜交、Real time RT-PCR技術(shù)探索研究了CaSTRAIL在類立克次體誘導(dǎo)刺激條件下的激活機理及其功能。結(jié)果顯示:CasTRAIL在外套膜、血淋巴和肌肉中明顯增強,在鰓中顯著降低,而在性腺中則未見明顯變化,表明CasTRAIL在類立克次體誘導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)中具有功能。二、類立克次體誘導(dǎo)刺激后近江牡蠣Tolloid-like、MAK3和p38MAPK基因的克隆與鑒定
　　 我們進一步克隆鑒定了近江牡蠣的Toll

7、oid-like,MAK3和p38基因,并對它們的功能進行了初步研究。①CaTLL全長3492 bp,具有一個2811 bp的讀碼框,編碼含936個氨基酸、分子量大小約103 kDa的蛋白,該蛋白含有蝦紅素超家族成員幾個特征性結(jié)構(gòu)域或基序:astacin-like結(jié)構(gòu)域、按CUB-CUB-EGF-CUB-EGF-CUB-CUB排列的CUBs和EGFs結(jié)構(gòu)域、RTRR基序、zn2+結(jié)合基序:HELGHVIGFWHEH和Met-turn:S

8、IMHY。其中astacin-like結(jié)構(gòu)域與其它動物該結(jié)構(gòu)域的相似度在30％-97％之間,提示其催化功能的保守性。RT-PCR結(jié)果顯示:CaTLL在各正常組織中均有表達,在鰓中的表達量較高,在血淋巴細胞中的表達量顯著偏低；而實時定量PCR結(jié)果顯示:類立克次體誘導(dǎo)刺激后血淋巴細胞中CaTLL的表達明顯增強,表明CaTLL與RLO誘導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)有關(guān)。②CaMAK3基因的編碼序列長510bp,具有一個510 bp的完整讀碼框,編碼169

9、個氨基酸、分子量大小約18.6 kDa的蛋白,該蛋白的特征性結(jié)構(gòu)域Acetyltransf1與酵母菌的相似度為27％；與各種動物的相似度在53％-100％之間,是一個非常保守的結(jié)構(gòu)域。RT-PCR結(jié)果顯示:CaMAK3在各正常組織中均有表達,其中鰓和血淋巴細胞中表達量較高,外套膜和閉殼肌中的表達量較低；而在類立克次體誘導(dǎo)刺激后血淋巴細胞中的表達明顯增強,表明CaMAK3與RLO誘導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)有關(guān)。③Cap38全長1244 bp,含有

10、一個1065 bp的完整讀碼框,編碼355個氨基酸的蛋白質(zhì),其分子量近39 kDa。該蛋白含有一個保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域S_TKc,該結(jié)構(gòu)域和其它動物的相似度在62％和77％之間,說明p38蛋白是一個較保守的激酶。RT-PCR結(jié)果顯示:p38在各組織中均有表達,其中鰓、血淋巴細胞和外套膜中表達量較高；而在類立克次體誘導(dǎo)刺激后血淋巴細胞中Cap38的表達水平在15min后即迅速增至峰值,表明Cap38在RLO誘導(dǎo)的宿主免疫

11、反應(yīng)中具有一定作用。
　　 綜合上述結(jié)果得到如下結(jié)論:CasTRAIL在類立克次體誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中,類立克次體可以誘導(dǎo)增強CasTRAIL的表達水平,證明了CasTRAIL具有免疫功能,且CasTRAIL重組蛋白誘導(dǎo)試驗證明CasTRAIL可從mRNA和蛋白兩個水平上同時激活p38-MAPK的表達,表明在CasTRAIL介導(dǎo)的抗類立克次體感染的免疫反應(yīng)中,可能和p38-MAPK介導(dǎo)的信號通路有關(guān)；而Tolloid-like,MA

12、K3和p38等基因在類立克次體誘導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)中都具有一定的功能。鑒于這些結(jié)果,病原/TRAIL/MAPKs/信號途徑可能存在于牡蠣天然免疫系統(tǒng)中,而Tolloid-like,MAK3可能在對該信號途徑進行調(diào)節(jié)、修飾等方面發(fā)揮一定作用,從而共同抵御外來病原的入侵。另外,通過檢測p38,ERK,JNK等MAPks激酶磷酸化水平的變化,證明CasTRAIL蛋白對正常血淋巴細胞無毒性作用,但對人類的腫瘤細胞具有細胞毒作用,可引起腫瘤細胞HL