分枝桿菌同源膜錨定表達載體的構(gòu)建與細胞定位分析.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起結(jié)核病(tuberculosis)的病原菌,而卡介苗(bacillus Calmette-Guérin,BCG)是全球公認的唯一有效的結(jié)核疫苗。通過表達某些重要保護性抗原編碼基因來構(gòu)建重組卡介苗(recombinantbacillus Calmette-Guérin,rBCG)是改進結(jié)核疫苗效力的重要方法之一。通常情況下,構(gòu)建的rBCG將抗原分泌至胞外或錨定于細胞

2、外膜表面,可更為有效地遞呈并產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
　　 目的：比較結(jié)核分枝桿菌(M.tb)突變型啟動子pfurAma的突變體pfurAma-N和pfurAma-N3以及phsp60控制基因表達的活性,用以構(gòu)建分枝桿菌膜錨定表達載體,并分析外源目的蛋白的表達情況及其亞細胞定位分析。
　　 方法：PCR擴增啟動子pfurAma突變體,并在其5’端額外引入Nde I酶切位點以便于信號序列或標簽分子的克隆,并將導(dǎo)致的pfurAma-N

3、(pfurAma啟動子起始密碼子上游-3～-1位AGT→CAT突變)和pfurAma-N3(pfurAma啟動子起始密碼子上游-1位增加三個密碼子CAT)分別亞克隆入探針載體pMC210,以pfurAma和phsp60啟動子重組報告質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌mc2155,通過檢測胞外β-半乳糖苷酶活性評估啟動子活性。然后選取最強的啟動子pfurAma-N取代pMV261載體中的phsp60啟動子,從而構(gòu)建胞內(nèi)表達載體pMFA42。隨后,

4、人工合成帶有Nde I和BamH I粘性末端的結(jié)核分枝桿菌19 kDa抗原膜結(jié)合信號序列的正義鏈和反義鏈,退火后將其直接亞克隆至pMFA42載體中構(gòu)建膜錨定表達載體pMFA42M。PCR擴增增強型綠色熒光蛋白(EGFP)編碼基因,分別亞克隆至上述兩種不同類型的載體中并電轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌(M.s),分別獲得重組EGFP融合胞內(nèi)表達菌株和膜錨定表達菌株:接著,將M.tb主要保護性抗原Ag85A及其嵌合抗原Ag856A2的編碼基因亞克隆入膜錨

5、定表達載體pMFA42M中構(gòu)建M.tb抗原-EGFP融合表達菌株；通過Western-blot和流式細胞表面標記技術(shù)來分析目的抗原的表達水平及其亞細胞定位,并進一步通過熒光顯微鏡直接觀察重組EGFP融合表達菌株在體外和感染巨噬細胞后的熒光強度。
　　 結(jié)果：成功擴增出啟動子突變體pfurAma-N和pfurAma-N3,啟動子活性分析發(fā)現(xiàn)pfurAma啟動子起始密碼子上游三位密碼子的突變并不影響啟動子活性,pfurAma-N與p

6、furAma活性相當,均為phsp60活性的2倍左右;而增加啟動子和起始密碼間的距離則將導(dǎo)致其活性顯著下降,pfurAma-N3活性僅為phsp60的一半。通過引入M.tb19 kDa脂蛋白膜分泌信號,在高效的啟動子pfurAma-N的驅(qū)動下,成功地構(gòu)建了分枝桿菌膜錨定表達載體。利用EGFP作為標簽抗原,通過Western—blot、熒光顯微觀察和流式細胞表面標記等技術(shù)均證實了外源目的抗原可在分枝桿菌中高水平表達并定位至細胞膜上。