抗牛結(jié)核分枝桿菌VHH抗體庫(kù)的構(gòu)建與篩選.pdf

1、牛結(jié)核病(bovine tuberculosis)是一種死亡率極高的慢性人畜共患傳染病，對(duì)公共衛(wèi)生具有極大的威脅。1882年羅伯特·科赫發(fā)現(xiàn)了結(jié)核病發(fā)病主要是因?yàn)楦腥玖私Y(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis，MTB)，其中一定比例都是牛結(jié)核分枝桿菌引起的。牛結(jié)核分枝桿菌抗干旱抗低溫，具有較強(qiáng)的耐藥性，可以在惡劣的環(huán)境下生存，對(duì)牛結(jié)核病的防治造成了困難。
　　1993年，比利時(shí)科學(xué)家Hamers發(fā)現(xiàn)駱駝體內(nèi)存在一種天然缺失輕鏈的

2、重鏈抗體，僅由其可變區(qū)組成的抗體稱為單域抗體，又稱為VHH抗體。VHH抗體具有高親和力、高穩(wěn)定性、強(qiáng)組織穿透性、高效表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。因此構(gòu)建抗牛結(jié)核分枝桿菌VHH抗體庫(kù)，并利用噬菌體展示技術(shù)和蛋白芯片對(duì)接技術(shù)獲得高表達(dá)、特異性強(qiáng)的VHH抗體，為診斷與治療結(jié)核病奠定基礎(chǔ)。本文的主要研究結(jié)果如下:
　　1.牛結(jié)核分枝桿菌Ag85B蛋白的表達(dá)、純化。采用BL21(DE3)(pET28a-ag85B)重組菌株，經(jīng)表達(dá)、純化、復(fù)性，獲得具有活性

3、的高濃度Ag85B蛋白。
　　2.抗牛結(jié)核分枝桿菌VHH抗體庫(kù)的構(gòu)建及鑒定。實(shí)驗(yàn)使用BCG免疫駱駝，從駱駝外周血中分離淋巴細(xì)胞提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用巢式PCR擴(kuò)增VHH抗體基因片段。將目的基因片段和pCANTAB5e載體用NotⅠ和SfiⅠ進(jìn)行雙酶切，用T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)TG1大腸桿菌內(nèi)，構(gòu)建VHH抗體初級(jí)文庫(kù)。對(duì)建立的VHH抗體庫(kù)進(jìn)行鑒定，文庫(kù)庫(kù)容為7.35×106。隨機(jī)挑選24個(gè)單菌落進(jìn)行菌液PCR，結(jié)果

4、表明文庫(kù)陽(yáng)性率為91.7％。通過DNAMAN分析氨基酸序列，氨基酸序列同源性為66.48％。說明構(gòu)建獲得的VHH抗體庫(kù)多樣性豐富，庫(kù)容大小足以滿足特異性抗體的篩選。
　　3.抗牛結(jié)核分枝桿菌Ag85B特異性VHH抗體的篩選。以Ag85B蛋白為抗原，利用噬菌體表面展示技術(shù)的原理，使用M13K07輔助噬菌體進(jìn)行“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的淘選。經(jīng)過三輪淘選后富集度達(dá)到102。以Ag85B蛋白為抗原通過蛋白芯片互作的方法隨機(jī)挑取大量單克隆進(jìn)行