ITP患者細(xì)胞毒和巨核細(xì)胞異常對(duì)血小板的影響及機(jī)制探討.pdf

1、特發(fā)性血小板減少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura ITP）是臨床最為常見的出血性、自身免疫性疾病，約占出血性疾病總數(shù)的30％。以外周血小板減少、骨髓巨核細(xì)胞正?；蛟龆喟槌墒煺系K為主要表現(xiàn)。目前，治療以長期使用腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及脾切除等方法為主，容易引發(fā)感染、骨髓抑制等，并且約有1/3的患者上述治療無效，遷延不愈，甚至危及生命。 本病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全闡明。長期以來由

2、自身抗體介導(dǎo)的血小板破壞增多被看成是ITP的主要病因。即血小板膜表面糖蛋白（glycoprotein，GP）作為自身抗原，特別是GPⅡb/Ⅲa和GPⅠb/Ⅸ復(fù)合物，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性自身抗體，通過其Fab段與自身抗原結(jié)合，致敏的血小板容易被機(jī)體的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所清除，特別是脾臟中的單核吞噬細(xì)胞吞噬破壞，從而導(dǎo)致血小板減少。 但是ITP發(fā)病具有明顯的異質(zhì)性。隨著研究的深入，體液免疫異常在ITP發(fā)病過程中起決定性作用的觀點(diǎn)已日

3、益受到挑戰(zhàn)。由于血小板自身抗體只能在50％-70％ITP患者中檢測(cè)到，并且陰性結(jié)果不能排除診斷。多數(shù)研究認(rèn)為ITP患者呈Th1優(yōu)勢(shì)反應(yīng)模式，而Th1優(yōu)勢(shì)反應(yīng)除可促進(jìn)抗體產(chǎn)生外，還能直接促進(jìn)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。因此，近年來細(xì)胞免疫功能失調(diào)在ITP發(fā)病中的作用越來越受重視。研究發(fā)現(xiàn)ITP患者外周血CD8+細(xì)胞增多，CD4+/CD8+下降。Olsson等應(yīng)用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)在ITP患者與細(xì)胞毒作用有關(guān)的基因以及與Th1細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)的基因表達(dá)

4、增高，提示細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用可能在ITP發(fā)病中起重要作用。隨后，Olsson等和張峰等的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL，CD8+T）能直接參與對(duì)ITP患者血小板的殺傷，導(dǎo)致血小板持續(xù)破壞。 目前普遍認(rèn)為，除血小板破壞增多外，血小板生成減少也參與ITP的發(fā)病。血小板動(dòng)力學(xué)研究及骨髓巨核細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查均證實(shí)ITP患者的血小板生成減少。既然巨核細(xì)胞表面亦表達(dá)GPⅡb/Ⅲa和GPⅠ

5、b/Ⅸ，血小板自身抗體同樣可以作用于巨核細(xì)胞，影響巨核細(xì)胞生成或?qū)е戮藓思?xì)胞在骨髓內(nèi)被活化的補(bǔ)體或吞噬細(xì)胞破壞。多項(xiàng)研究證實(shí)，純化的血小板膜糖蛋白抗體能夠抑制巨核細(xì)胞集落的增殖，進(jìn)而影響血小板生成。Chang等和McMillan等發(fā)現(xiàn)ITP患者血漿和純化的血小板自身抗體可抑制體外巨核細(xì)胞生長，導(dǎo)致巨核細(xì)胞數(shù)量明顯降低。充分證明血小板特異性抗原的自身抗體不僅介導(dǎo)外周血小板破壞，還影響骨髓中巨核細(xì)胞的生長和發(fā)育成熟。但是多數(shù)ITP患者骨髓中

6、巨核細(xì)胞數(shù)量正常或增多，其血小板生成減少不能用巨核細(xì)胞數(shù)量降低解釋。 血小板生成與成熟巨核細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，巨核細(xì)胞凋亡異常即會(huì)引起血小板生成障礙。對(duì)ITP患者骨髓巨核細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的研究表明，患者的巨核細(xì)胞存在廣泛的異常，這些異常的巨核細(xì)胞發(fā)生與凋亡相似但不同于凋亡的程序性細(xì)胞死亡，是導(dǎo)致血小板生成減少的重要原因。 我們首先應(yīng)用改良MAIPA技術(shù)檢測(cè)ITP患者血漿中的特異性血小板膜糖蛋白（GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ）

7、自身抗體水平，以雙色流式細(xì)胞技術(shù)為基礎(chǔ)的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)ITP患者及正常對(duì)照CTL對(duì)自身血小板的殺傷效應(yīng)，比較MAIPA陽性和陰性ITP患者CTL對(duì)自體血小板的殺傷及地塞米松的作用。我們還將ITP患者血漿及其組分與正常臍血CD34+細(xì)胞共同孵育，定向擴(kuò)增巨核細(xì)胞，觀察ITP血漿及其組分對(duì)巨核細(xì)胞和血小板形成的影響。 第一部分細(xì)胞毒作用在ITP發(fā)病及地塞米松治療中的意義研究 目的： 比較MAIPA陽性和陰性ITP

8、患者細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞對(duì)自體血小板的殺傷及地塞米松的作用，分析自身細(xì)胞毒殺傷血小板與抗血小板自身抗體的關(guān)系。 方法： *抽取48例ITP患者和17例正常人的外周血15ml，其中患者標(biāo)本分別在大劑量地塞米松治療前和治療后兩周采樣。 *改良MAIPA檢測(cè)ITP患者血漿中抗GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ自身抗體。 *從外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞和血小板。 *用免疫磁珠分離技術(shù)分離CD8+細(xì)胞。 *以自身

9、血小板為靶細(xì)胞，以CD8+細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)。 *用CD41a和AnnexinⅤ標(biāo)記血小板，流式細(xì)胞儀分析被AnnexinⅤ標(biāo)記的血小板比例（血小板裂解率），以間接反映效應(yīng)細(xì)胞的殺傷能力。 *在ITP患者M(jìn)AIPA陽性組與陰性組間進(jìn)行細(xì)胞毒作用的比較。 結(jié)論： *證實(shí)了細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用參與了ITP患者血小板破壞，而且在檢測(cè)不到抗GPⅡb/Ⅲa、Ⅰb/Ⅸ抗體的ITP患者發(fā)病中發(fā)揮更大作用。

10、 *地塞米松可能有抑制CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒殺傷血小板作用。保護(hù)自身血小板免受細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用是HD-DXM發(fā)揮治療作用的機(jī)制之一。 *干預(yù)CTL介導(dǎo)的血小板破壞可能成為ITP治療的一個(gè)新靶點(diǎn) 第二部分 ITP患者血漿對(duì)體外巨核細(xì)胞和血小板形成的影響及機(jī)制探討 目的： 研究ITP血漿及其組分對(duì)正常臍血CD34+細(xì)胞定向擴(kuò)增巨核細(xì)胞和血小板形成的影響。 方法： *留取49例ITP患者和22

11、例正常人的外周血血漿。 *用免疫磁珠分離技術(shù)分離臍血CD34+細(xì)胞。 *親和層析法提取ITP患者和正常對(duì)照血漿IgG。 * ITP患者血漿的自身抗體吸附。 * CD34+細(xì)胞與ITP患者或正常對(duì)照血漿、IgG、自身抗體吸附后血漿共同孵育，定向擴(kuò)增巨核細(xì)胞。 *流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD41a的表達(dá)。 *檢測(cè)培養(yǎng)體系中生成的血小板。 * CD41a+細(xì)胞DNA倍體分析。 * CD41