川芎嗪和人參皂苷Rg1對Caco-2細(xì)胞p-糖蛋白功能和表達(dá)的影響.pdf

1、一、目的 研究川芎嗪、人參皂苷Rgl單用以及它們合用時(shí)對p-糖蛋白功能和表達(dá)的影響。 二、方法 1.細(xì)胞培養(yǎng)以及形態(tài)學(xué)驗(yàn)證培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV以及建Caco-2單層細(xì)胞模型，用于研究川芎嗪和人參皂苷Rgl，對p-糖蛋白功能和表達(dá)的影響。Caco-2細(xì)胞和ECV細(xì)胞均采用DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)；細(xì)胞熒光免疫法進(jìn)行p-糖蛋白表達(dá)驗(yàn)證；用Transwell板接種Caco-2細(xì)胞建立單層模型

2、，采用細(xì)胞電位儀、熒光黃及普奈洛爾轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行模型驗(yàn)證。 2.細(xì)胞毒性試驗(yàn)采用MTT法，確定川芎嗪和人參皂苷Rgl的體外最大非細(xì)胞毒劑量，保證試驗(yàn)過程中細(xì)胞的活性。 3.羅丹明-123外排試驗(yàn)以ECV細(xì)胞作陰性對照細(xì)胞，環(huán)孢素A作為p-糖蛋白功能抑制的陽性對照，使用高效液相紫外法研究川芎嗪和人參皂苷Rgl對p-糖蛋白底物羅丹明-123在Caco-2細(xì)胞中外排功能的影響。 4.羅丹明-123轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)環(huán)孢素A作為p-

3、糖蛋白功能抑制的陽性對照，建立Caco-2單層細(xì)胞膜型，進(jìn)一步研究川芎嗪和人參皂苷Rgl對羅丹明-123跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響。 5.p-糖蛋白表達(dá)的測定使用流式細(xì)胞儀分析川芎嗪和人參皂苷Rgl對Caco-2細(xì)胞上p-糖蛋白表達(dá)量的影響。 三、結(jié)果 1.細(xì)胞培養(yǎng)以及形態(tài)學(xué)驗(yàn)證Caco-2和ECV細(xì)胞形態(tài)正常；Caco-2單層細(xì)胞模型緊密且完整，細(xì)胞旁及跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)通路通透性良好；Caco-2細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)p-糖蛋白，E

4、CV細(xì)胞弱表達(dá)p.糖蛋白；Caco-2單層細(xì)胞模型成功建立，可用于川芎嗪和人參皂苷Rgl對p-糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能；ECV細(xì)胞適合作為陰性對照細(xì)胞。 2.細(xì)胞毒性試驗(yàn)川芎嗪和人參皂苷Rgl分別在60～240μg/mL和6～24μg/mL范圍內(nèi)為非細(xì)胞毒性劑量，與細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后細(xì)胞的存活率大于90％。 3.川芎嗪和人參皂苷Rgl對羅丹明-123外排的影響中、高濃度(120、 240μg/mL)的川芎嗪能夠顯著降低羅丹明-12

5、3從Caco-2細(xì)胞的外排(p<0.05)。中濃度的人參皂苷Rgl對羅丹明-123的外排影響不大，沒有顯著性差異(p>0.05)。高濃度(20μg/mL)人參皂苷Rgl對外排有影響(p<0.05)。中濃度的川芎嗪和人參皂苷Rgl(120、20μg/mL)合用時(shí)，對羅丹明-123的外排有顯著的協(xié)同抑制作用排(p<0.05)。 4.川芎嗪和人參皂苷rgl對羅丹明-123跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響中、高濃度(120、 240μg/mL)的川芎

6、嗪在0.5、1.0和1.5h能夠使羅丹明-123從Caco-2單層細(xì)胞的腸腔側(cè)到腸內(nèi)壁側(cè)的累積轉(zhuǎn)運(yùn)量顯著增加(p<0.os)。中濃度(10μg/mL)的人參皂苷Rgl對羅丹明-123的轉(zhuǎn)運(yùn)無顯著影響(p>0.05)，高濃度的人參皂苷Rgl(20μg/mL)使羅丹明-123累積轉(zhuǎn)運(yùn)量顯著增加(p<0.05)。中濃度的人參皂苷Rgl和川芎嗪(120、20μg/mL)合用則對羅丹明-123從腸腔側(cè)到腸內(nèi)壁側(cè)的累積轉(zhuǎn)運(yùn)量具有協(xié)同增強(qiáng)作用(p<0

7、.05)。 5.川芎嗪和人參皂苷Rgl對Caeo-2細(xì)胞膜上p-糖蛋白表達(dá)的影響中、高濃度(120、240μg/mL)的川芎嗪使Caco-2細(xì)胞的p-糖蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(p<0.05)。中、高濃度(10、20μg/mL)的人參皂苷Rgl對p-糖蛋白的表達(dá)影響不大(p>0.05)。中濃度的人參皂苷Rgl與中濃度的川芎嗪(10、120μg/mL)合用后，對p-糖蛋白的下調(diào)無協(xié)同作用(p>0.05)。 四、結(jié)論 1

8、.川芎嗪是p-糖蛋白的底物，與p-糖蛋白上Rh-123受體競爭性結(jié)合，減少p-糖蛋白對細(xì)胞內(nèi)Rh-123的外排，增強(qiáng)Rh-123跨小腸上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)。同時(shí)川芎嗪也是p-糖蛋白的抑制劑，通過直接抑制p-糖蛋白的活性而影響p-糖蛋白功能，長時(shí)間應(yīng)用TMP可通過下調(diào)p-糖蛋白的表達(dá)水平影響降低腸道P-gp的活性。 2.人參皂苷Rgl是p-糖蛋白的抑制劑，高濃度的人參皂苷Rgl通過直接抑制p-糖蛋白的外排轉(zhuǎn)運(yùn)功能而影響腸道p-糖蛋白的功