殼聚糖銅在Caco-2細(xì)胞模型中的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)及在斷奶仔豬上的應(yīng)用研究.pdf

1、針對(duì)無(wú)機(jī)微量元素利用率低的難題，本研究自行制備了殼聚糖銅(CS-Cu)并進(jìn)行了表征，繼而運(yùn)用Caco-2細(xì)胞模型探討其吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，而后以斷奶仔豬為試驗(yàn)對(duì)象，研究了其對(duì)生產(chǎn)性能、糞銅排泄及組織微量元素含量的影響，旨在探討CS-Cu的吸收機(jī)理及其在仔豬上的應(yīng)用效果，為其作為新型有機(jī)銅源添加劑在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.殼聚糖銅的制備：正交試驗(yàn)結(jié)果表明，殼聚糖銅的最佳螯合條件為：殼

2、聚糖與Cu2+的質(zhì)量比為4:1，反應(yīng)體系的pH值為4.5，Cu2+起始濃度為6mg/ml，反應(yīng)時(shí)間為10h。AFM、XRD和FTIR表征結(jié)果顯示CS與Cu2+發(fā)生了配位反應(yīng)。
　　 2.Caco-2細(xì)胞模型的建立：Caco-2細(xì)胞在培養(yǎng)21d后，形成了緊密連接的單層，跨上皮細(xì)胞電阻達(dá)到了一個(gè)相對(duì)恒定的值，為567.94±31.85Ω·cm2；標(biāo)志性漏出物熒光素鈉在210min內(nèi)總透過(guò)率為2.39％；刷狀緣標(biāo)志性酶結(jié)果顯示，腸腔側(cè)

3、堿性磷酸酶活性顯著高于基底側(cè)酶活性，表明本試驗(yàn)構(gòu)建的Caco-2細(xì)胞模型符合公認(rèn)的小腸上皮吸收模型標(biāo)準(zhǔn)。
　　 3.CS-Cu在Caco-2細(xì)胞中的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)：CS-Cu和CuSO4在AP→BL和BL→AP的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取過(guò)程中，轉(zhuǎn)運(yùn)量和攝取量呈濃度和時(shí)間(除濃度外，其他條件下只研究了AP→BL的轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取)依賴性增加，其中CuSO4組的轉(zhuǎn)運(yùn)量和攝取量顯著高于CS-Cu組(P<0.05)，但在濃度增至15μmol/L時(shí)，CS-Cu

4、在細(xì)胞中的攝取量呈飽和趨勢(shì)；在4℃孵育條件下，CS-Cu和CuSO4在AP→BL的轉(zhuǎn)運(yùn)量和攝取量與37℃時(shí)相比顯著降低(P<0.05)，與CuSO4組相比，CS-Cu組的轉(zhuǎn)運(yùn)量和攝取量有升高趨勢(shì)。Caco-2細(xì)胞對(duì)CS與CuSO4混合物的轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取顯著低于CS-Cu和CuSO4(P<0.05)。結(jié)果提示CS-Cu在Caco-2細(xì)胞中的吸收可能是通過(guò)主動(dòng)吸收和跨細(xì)胞途徑的被動(dòng)吸收同時(shí)進(jìn)行的過(guò)程，而CuSO4可能只以單一方式進(jìn)行吸收，即在低

5、濃度時(shí)進(jìn)行主動(dòng)吸收，高濃度則以被動(dòng)吸收為主，同時(shí)細(xì)胞對(duì)CS-Cu的轉(zhuǎn)運(yùn)量和攝取量顯著高于CS與CuSO4混合物。
　　 4.CS-Cu在斷奶仔豬中的應(yīng)用：在飼料中添加50 mg·kg-1CS-Cu(CS-Cu-50)、100mg·kg-1 CS-Cu(CS-Cu-100)和200 mg·kg-1硫酸銅，都不同程度地促進(jìn)了仔豬生長(zhǎng)。與對(duì)照組(不添加外源銅)相比，CS-Cu-50組、CS-Cu-100組和200 mg·kg-1硫酸銅

6、組的日增重分別提高了14.6％(P<0.05)、26.3(P<0.05)、28.5％(P<0.05)，料重比分別降低了14.0％(P<0.05)、21.8％(P<0.05)和22.3％(P<0.05)，其中CS-Cu-100組的日增重和料重比與200 mg·kg-1硫酸銅組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)；與200 mg·kg-1硫酸銅組相比，CS-Cu-50、CS-Cu-100組腹瀉率有降低趨勢(shì)(P>0.05)。組織中銅含量測(cè)定結(jié)果表明

7、：與200 mg·kg-1硫酸銅組相比，CS-Cu-50組和CS-Cu-100組肝臟中銅殘留量分別降低了85.3％(P<0.05)和80.6％(P<0.05)，腎銅殘留量分別降低了29.5％(P<0.05)和13.9％(P<0.05)，膽汁銅降低了38.7％(P<0.05)和42.8％(P<0.05)。糞銅含量測(cè)定結(jié)果顯示：CS-Cu-50組和CS-Cu-100組糞銅排泄量較200 mg·kg-1硫酸銅組大幅降低，分別減少75.8％(P

8、<0.05)、69.4％(P<0.05)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在與硫酸銅組生產(chǎn)性能相似的條件下，日糧中添加100 mg·kg-1CS-Cu明顯促進(jìn)了斷奶仔豬的生長(zhǎng)，而且CS-Cu-100組顯著降低了肝臟、腎臟和膽汁中銅含量以及糞銅的排泄量。
　　 上述結(jié)果提示：(1)本試驗(yàn)成功制備了殼聚糖銅，AFM、XRD和FTIR表征結(jié)果顯示CS與Cu2+發(fā)生了配位反應(yīng)；(2)培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞單層形態(tài)、跨膜電阻、堿性磷酸酶活性、熒光素鈉透過(guò)

9、率均符合要求，可以作為模擬小腸吸收的體外模型；(3)CS-Cu在Caco-2細(xì)胞中的吸收可能是主動(dòng)吸收和跨細(xì)胞途徑的被動(dòng)吸收同時(shí)進(jìn)行的過(guò)程，而且細(xì)胞對(duì)CS-Cu的轉(zhuǎn)運(yùn)量和攝取量顯著高于CS與CuSO4混合物；(4)100 mg·kg-1CS-Cu可明顯促進(jìn)斷奶仔豬生長(zhǎng)，提高飼料利用率，與200mg·kg-1硫酸銅相比具有同等促生長(zhǎng)效果且有降低腹瀉率趨勢(shì)；在不改變生長(zhǎng)性能的前提下，與高劑量CuSO4(200mg/kg)相比，100 mg/