神經(jīng)介素U2受體激動(dòng)劑先導(dǎo)分子在Caco-2細(xì)胞中的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)特征.pdf

1、神經(jīng)介素U2受體(NMU2R)是神經(jīng)介素U(Neuromedin U)在中樞表達(dá)的一個(gè)受體,對(duì)NMU中樞介導(dǎo)的攝食行為和機(jī)體能量代謝平衡有重要的調(diào)控作用,是一個(gè)潛在的代謝行疾病(如肥胖癥、2型糖尿病等)重要基因靶標(biāo)。運(yùn)用化學(xué)生物學(xué)手段來尋找和發(fā)現(xiàn)NMU2R高選擇性激動(dòng)劑,并以它們?yōu)樘结樕钊胙芯恐袠蠳MU信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,對(duì)了解代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制以及對(duì)治療這些疾病藥物研發(fā)都有十分重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。我們研究所在前期運(yùn)用NMU2R激動(dòng)劑高通

2、量篩選技術(shù)從中草藥天然化合物庫中篩選出了能有效激活NMU2R的小分子天然物質(zhì)EUK2000和EUK2010。肥胖大鼠體內(nèi)研究證明,這些化合物能夠降低體重,降低血糖水平和改善胰島素敏感性。對(duì)這些小分子天然物質(zhì)以及對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾而得到的NMU2R激動(dòng)劑先導(dǎo)分子(如EUK2030和EUK2085)進(jìn)行藥物臨床前研究具有重要意義。 P-糖蛋白以及與多藥物抵抗相關(guān)蛋白(MRP)在體內(nèi)發(fā)揮著重要的藥物抵抗功能。很多化合物可以和這些蛋白相互

3、作用,影響到它們?cè)隗w內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄的過程。我們對(duì)上述NMU2R激動(dòng)劑先導(dǎo)分子(EUK化合物)的在小腸的吸收情況以及與P-糖蛋白和MRP蛋白之間的相互作用還不清楚。 本文旨在培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞來模擬人類小腸,運(yùn)用HPLC、鈣黃綠素體系以及RT-PCR等技術(shù),從細(xì)胞、基因和蛋白水平較全面考察這些先導(dǎo)分子在Caco-2細(xì)胞上的攝取轉(zhuǎn)運(yùn)特征及與P-糖蛋白和MRP蛋白之間的相互作用。 1.NMU2R激動(dòng)劑在Caco-

4、2細(xì)胞上的攝取特征 為考察NMU2R激動(dòng)劑在Caco-2細(xì)胞上的攝取特征,將不同濃度NMU2R激動(dòng)劑和或不和P-糖蛋白的特異性抑制劑維拉帕米在Caco-2細(xì)胞上共同作用60分鐘后,超聲破碎細(xì)胞,HPLC法定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)這些化合物的攝取量。結(jié)果顯示,EUK2000、EUK2030和EUK2085均可被Caco-2細(xì)胞攝取,且攝取量與初始濃度顯著相關(guān),說明它們是以被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的方式被Caco-2細(xì)胞攝取的；與維拉帕米共同作用時(shí),細(xì)胞攝取

5、的量均顯著增加,說明它們都是P-糖蛋白的底物。而EUK2010不能被Caco-2細(xì)胞攝取。 2.NMU2R激動(dòng)劑在Caco-2細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運(yùn) 為考察NMU2R激動(dòng)劑在人類小腸的吸收情況,在插入式培養(yǎng)皿上種植Caco-2細(xì)胞,培養(yǎng)21天后,模擬人類小腸進(jìn)行EUK化合物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn),HPLC法定量分析。結(jié)果表明,EUK2085在Caco-2細(xì)胞上較易通透,其表觀通透系數(shù):Papp=1.54×10-5cm/s。而EUK2000

6、、EUK2010及EUK2030均不能在Caco-2細(xì)胞上轉(zhuǎn)運(yùn)。 3.NMU2R激動(dòng)劑對(duì)Caeo-2細(xì)胞上MDR1,MRP1和MRP2基因表達(dá)的影響 為考察NMU2R激動(dòng)劑對(duì)Caco-2細(xì)胞上與藥物抵抗有關(guān)基因表達(dá)的影響,將不同濃度的NMU2R激動(dòng)劑分別作用于Caco-2細(xì)胞48和72小時(shí)后,提取RNA,并反轉(zhuǎn)成cDNA,再采用RT-PCR的技術(shù)進(jìn)行定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),EUK2000對(duì)MDR1,MRP1和MRP2基因表達(dá)均具

7、抑制作用,而EUK2030和EUK2085均可上調(diào)MDR1、MRP1和MRP2基因的表達(dá)。而EUK2010對(duì)MDR1、MRP1基因表達(dá)無影響。 4.NMU2R激動(dòng)劑先導(dǎo)分子對(duì)P-糖蛋白和/或MRP蛋白的抑制作用 為考察NMU2R激動(dòng)劑對(duì)Caco-2細(xì)胞上P-糖蛋白和/或MRP蛋白有無抑制作用,我們利用了鈣黃綠素體系(calcein AM assay)。結(jié)果顯示,EUK2000和EUK2085均對(duì)P-糖蛋白或MRP蛋白有抑