高分辨率熔解曲線分析檢測大腸腫瘤糞便DNA突變性能評價.pdf

1、研究背景和目的：
　　 全球結直腸癌(CRC)發(fā)病率位于惡性腫瘤的第3位，我國位于第4～6位，呈逐年上升的趨勢。廣東省CRC發(fā)病率的上升速度較快。CRC的預后與早期診斷密切相關。絕大多數(shù)CRC是由“正常-腺瘤-癌”逐步演變而來，從可辨認的腺瘤發(fā)展為侵襲性癌約需5-10年，這為預防及早期篩查提供了充裕的時間。大量研究已證實發(fā)生癌變的腺瘤主要為晚期腺瘤(AA，指直徑≥1cm或組織學證實為絨毛狀腺瘤或重度異型性增生的腺瘤)，通過臨床篩

2、查并及時切除癌前病變如腺瘤，可降低CRC發(fā)病率及病死率。
　　 結腸鏡檢查因準確性高且能治療而被首選，但存在需要專業(yè)的內鏡醫(yī)生、風險較大、費用高、患者接受性差等不足，難以大規(guī)模應用于無癥狀人群的篩查;糞便隱血試驗(FOBT)具有簡便、無創(chuàng)、經濟，接受性好等優(yōu)點而被優(yōu)選，但存在假陽性率及假陰性率較高、需要多次送檢等不足，由于腺瘤檢出率敏感度低，因而對癌癥發(fā)病率的影響小;糞便DNA檢測具有只需一次送檢、易接受、依從性高、不需服藥或控

3、制飲食、不受腫瘤部位影響等優(yōu)點而被重視。大量研究表明糞便DNA檢測的敏感性和特異性比FOBT好，尤其腺瘤檢出率高引人注目。已列為美國指南候選方法。
　　 但現(xiàn)有的糞便DNA檢測方案尚需完善，主要是敏感性與特異性有待提高，費用需降低、操作需簡單化等。除了尚需進一步優(yōu)化/更替現(xiàn)有的標志物組合外，升級現(xiàn)有的檢測方法也是關鍵環(huán)節(jié)?，F(xiàn)有的高敏感性和特異性的糞便DNA檢測方法，普遍存在費用高、操作復雜、過于專業(yè)化、受制于待檢目標基因位點的等

4、問題。因此尋求一種便捷易用、經濟高效的檢測方法是提升糞便DNA檢測實用價值的必要條件。
　　 高分辨率熔解曲線分析(HRMA)是猶他州大學Wittwer實驗室與美國Idaho公司聯(lián)合研制的一種PCR后閉管操作技術:通過高密度熒光數(shù)據(jù)采集，直接用熔解曲線檢測PCR擴增片段中微小序列差別。具有低成本、高通量、無污染、快捷、操作簡單、不受變異位置影響、敏感性及特異性好等優(yōu)勢。自2003年被引入檢測基因突變以來，HRMA的應用與發(fā)展如“

5、雨后春筍”，在醫(yī)學分子診斷中越來越受到關注。經薈萃分析發(fā)現(xiàn)其靈敏度達97.5％(95％置信區(qū)間(CI)，96.8-98.5)、特異度達95.8％(95％CI:95.3-96.3)，DNA樣本的來源及飽合染料類型均對HRMA的靈敏度無影響。我們前期的研究已經初步展示HRMA用于糞便DNA突變檢測，獲得較高的檢出率，具有潛在臨床應用價值。目前國內尚無有關評價HRMA方法用于糞便DNA檢測篩查CRC的文獻報道。
　　 因此，本研究在前

6、期研究基礎上，以DNA測序結果作為金標準，擴大樣本量、更新試驗設計方案、優(yōu)化實驗條件及操作流程等方式對HRMA的準確性展開較為全面的評價性研究。首先在組織樣本中建立與優(yōu)化HRMA操作流程與實驗參數(shù);然后，在2個獨立的樣本集(包括“學習集”與“驗證集”階段)中對HRMA應用于糞便DNAKRAS與TP53突變的檢測的敏感性和特異性進行全面評價;同時，在DNA系列稀釋試驗中評估HRMA技術的敏感性:最后，探討檢出的糞便KRAS、TP53突變與

7、大腸腫瘤性病變的臨床病理特征參數(shù)的關系及診斷價值。
　　 方法：
　　 研究對象:2010.1-2010.7間在惠州市中心醫(yī)院及南方醫(yī)院接受腸鏡檢查者和/或普外科住院的術前CRC與AA患者中，及腸鏡檢查未發(fā)現(xiàn)明顯異常的病人中。按下列納入與排除標準，連續(xù)收集這些患者的糞便標本與臨床病理特征參數(shù)資料，在“學習集”部分收集相應的腫瘤的FFPE組織標本。
　　 研究組納入標準:(1)年齡大于40歲、且病理組織學檢查確診為

8、結直腸AA與CRC患者;(2)能同時收集病變組織與合格糞便樣本(重量不低于5克)的患者。
　　 研究組排除標準:(1)家族性或遺傳性結直腸腺瘤或腫瘤;其他系統(tǒng)或器官腫瘤。(2)共患有炎癥性腸病;(3)術前有放療或化療史;(4)妊娠或有嚴重肝腎功能不全者;(5)非原發(fā)癌灶者及不能確診等其他情況;(6)既往有CRC或腺瘤病史;(7)肉眼見全血性大便者。
　　 糞便樣本采集:在內鏡檢查或腫瘤切除手術前、接受任何形式的結直腸侵入

9、性操作或服用瀉劑腸道準備的1周后，收集至少5克新鮮糞便量于48小時內盡快凍存于-80℃冰箱待用。
　　 DNA提取與質控:按QIAamp糞便DNA、FFPEDNA的提取試劑盒的說明書方法提取DNA，在FFPE組織取樣時，采用傳統(tǒng)手工微切的方法，保留每一塊樣本中含有腫瘤細胞占的比例≥50％。提取DNA的濃度和純度測定均用NanoDropND-1000分光光度計檢測，達標要求:濃度≥50ng/μL，260/280nm的吸光度位于1.

10、6-2.2且230/260nm位于2.0-2.5。達標的樣本DNA均稀釋到50ng/μL的終濃度，置入-20℃冰箱保存待用。
　　 HRMA檢測:基于NCBI的TP53外顯子5-8、KRAS2-3的參考基因序列設計引物，KRASExon2(92bp)f-TTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAA，r-TGAAT-TAGCTGTATCGTCAAGGCACT;Exon2(155bp)f-TTATAAGGCCTGCTGAA

11、AAT-GACTGAA,r-TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACT,Exon3f-GACTGTGTTTCT-CCCTTCTC,r-TGTACTGGTCCCTCATTGC;TP53Exon5f-GTGCAGCTGTGGGTT-GATT;r-AACCAGCCCTGTCGTCTCT,Exon6f-GATTCCTCACTGATTGCTCTTA-Gr-GGGCACCACCACACTATG;Exon7f-TTGGGCCTGTGTTAT

12、CTCCTr-TGGCAAGTGGCTCCTGAC,Exon8f-TTGCTTCTCTTTTCCTATCCTGAr-GCTTCTTGTCCTGCTTGCTT。其中，KRAS基因外顯子2，設計2對引物，擴增的片段分別為92bp和155bp。KRAS基因外顯子2(155bp)的檢測是在LightCycler480PCR儀上操作;其他的KRAS基因外顯子2(92bp)-3，TP53基因外顯子5-8基因均在Rotor-GeneTM6000PCR

13、儀上操作。反應體系:2μL(100ng)樣本DNA，上下引物各為1μL(200nmol/L)，鎂離子2μL(2.5mmol/L)，LightCycler480HRMMaster/qPCRMaster預混液12.5μL，加ddH2O至總體積25μL。反應條件參數(shù):95℃預熱5分鐘，95℃×15秒→60℃-63℃×50秒→72℃×30秒→72℃×10分鐘，共50個循環(huán)。PCR產物在95℃變性5分鐘，冷卻至40℃×1分鐘(讓異源雙鏈形成)然后

14、在65℃升至95℃間，熒光采集密度為25次/℃。HRMA分析:原始采集的熒光曲線經過正?；蜏囟日{整處理后，野生型基因被用來作為陰性對照。曲線圖形的差異表示擴增的樣本基因序列存在變異。HRMA突變陽性樣本記為異常熔解曲線。采集的數(shù)據(jù)經羅氏公司的基因分析軟件(1.5版)及RotorGene的軟件(V1.7.25版)分析得出結果。
　　 DNA測序檢測:首先，對PCR產物進行酶切純化:1、將每個樣本PCR產物使用1％的瓊脂糖凝膠進行

15、檢測，確認目的條帶是否單一;2、經上述瓊脂糖凝膠檢測條帶單一的，使用SAP(蝦堿性磷酸酶)和ExoI(外切核酸酶)進行酶切純化;3、經上述瓊脂糖凝膠檢測有非特異性的條帶，使用BioMIGA的瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行割膠回收。接著，在用在ABI3730DNA測序儀上進行單向測序，采用的是Sanger法。最后，使用3730XL軟件、DNAMAN軟件對測序數(shù)據(jù)進行分析，得出最終結果。所有樣本DNA的測序均送上海碩士生物有限公司檢測分析。

16、>　　 統(tǒng)計方法
　　 以α=0.05為檢驗水準，各組間年齡，兩樣本t檢驗;所有的計數(shù)資料的比較，多樣本間采用x2檢驗，四格表采用Fisher確切概率法，若配對資料采用McNemar檢驗，符合率采用Kappa分析。統(tǒng)計分析均使用SPSS13.0軟件包及EpiCalc2000統(tǒng)計軟件。
　　 結果：
　　 參與患者的臨床病理特征參數(shù)
　　 最初，有145例大腸腫瘤性病變患者，70例結腸鏡檢查陰性的病人(N

17、C)作對照組。28例因糞便樣本不符合納入與排除標準而剔除。接下來，187提取DNA，12例因DNA質量不達標而排除。最終納入研究共175例，63例CRC，52例AA，60例年齡相匹配的NC，所有參與者均是中國人。患者病情診斷的確定均是根據(jù)結腸鏡檢查結果和/或完整切除腫瘤的標本病理診斷。CRC組的平均年齡為61歲(41-87歲)，AA組的平均年齡為58歲(40-80歲)，對照組平均年齡為47歲(40-73歲);病例組男女性比例69/57，

18、其中CRC為32/31，AA為37/26，而對照組為24/36;CRC、AA原發(fā)部位位于近端結直腸分別為88.9％(56/63)、86.5％(45/52);Duck's分期中，A+B期占60.3％;病例組KRAS外顯子2-3突變率為26.1％(30/115)，TP53外顯子5-8突變率為21.7％(25/115)，對照組突變率3.3％(2/60)。
　　 “學習集”階段研究
　　 為了建立及優(yōu)化HRMA技術的實驗條件與參

19、數(shù)設定。我們在CRC與AA的組織樣本中，對HRMA檢測突變基因的準確性進行評價。先對合格的40例病人的FFPE的樣本進行測序證實KRAS外顯子2-3與TP53外顯子5-8基因突變情況，再用HRMA檢測其基因突變的情況，我們檢出22例病人有基因突變，其中17例來自29例CRC，5個來自AA，突變檢出率55％(22/40)。兩者檢測結果完全一致，其敏感度與特異度均為100％。隨后基于上述優(yōu)化的HRMA的技術操作流程，我們就對其相應的糞便DN

20、A的突變進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，HRMA檢出18例(18/40，45％)突變，其中，CRC14例(14/29，48.28％)，AA4例(4/11，36.36％)，這些檢測結果均被隨后的測序所證實，HRMA的敏感度與特異度均為100％。糞便DNA與相應組織的突變檢出率的符合率高度一致，18/22(81.82％)，其中CRC14/17(82.35％)，AA4/5(80％)，Kappa值為0.794，在CRC、AA中分別為0.794、0.814。

21、
　　 HRMA的敏感性分析
　　 為了評價HRMA在結直腸癌篩查的環(huán)境中檢測糞便DNA突變的可靠性，我們采用DNA的系列濃度稀釋試驗評估HRMA檢測最低水平基因突變的靈敏度。選用已知KRAS基因外顯子2及TP53基因外顯子6-8突變具體情況的糞便樣品DNA系列稀釋實驗，選用同樣的糞便DNA中的野生型樣本作為稀釋實驗的背景。我們發(fā)現(xiàn)，HRMA檢出突變基因的最低稀釋濃度限度為1％，但樣本間存在的差異大;HRMA能夠穩(wěn)定可靠

22、的檢出濃度為≥5％。
　　 “驗證集”階段研究
　　 基于前二個部分研究得出的HRMA具有與測序一致的敏感性與特異性，且檢出突變基因的最低濃度限度能達1％。促使我們在“驗證集”中進一步評價其準確性。75例病例組，包括34例CRC和41例AA，60例對照組。在病例組的糞便DNA中，共檢出含有KRAS和/或TP53基因突變頻率為(49.3％，37/75)，顯著高于對照組(3.3％，2/60)(P＜0.001);在病例組的亞組

23、分析中，基因突變率在CRC亞組(58.8％，20/34)與AA亞組(41.5％，17/41)之間的存在顯著性差異(P=0.02)。HRMA檢測的結果，均被隨后的測序證實，其敏感度與特異度均為100％。
　　 糞便基因突變與臨床病理特征參數(shù)關系及臨床診斷價值
　　 1、病例組中，CRC、AA原發(fā)于近端結直腸(88.9％、86.5％)明顯多于遠端結直腸(13.5％、11.1％);Duck's分期中，A+B期(60.3％)明顯

24、多于C+D期(39.7％);在病例組與對照組間，CRC亞組與AA亞組間，均存在顯著的性別構成比差異(P=0.004，P=0.035)，前者男性所占比例均明顯多于后者;對KRAS基因外顯子2突變，我們同時檢測二個不同長度的片段(155bp和92bp)，發(fā)現(xiàn)兩者的突變檢出率完全一致。
　　 2、在CRC組中，檢出19例(19/63，30.1％)KRAS突變，15例(15/63，23.8％)TP53突變。發(fā)現(xiàn)各基因突變頻率與性別、部位

25、、分化度、組織類型、大小、Duck's分期、年齡均無統(tǒng)計學上差異。3、在AA組中，檢出11例(11/52，21.2％)KRAS突變，10例(11/52，19.2％)TP53突變。發(fā)現(xiàn)TP53突變與年齡分組存在差異(P=0.036)，發(fā)現(xiàn)年齡≥60歲組突變檢出率32.0％(8/25)高于＜60歲組7.4％(2/27)。但發(fā)現(xiàn)各基因突變頻率與性別、部位、異型增生度、組織類型、大小均無統(tǒng)計學差異。
　　 4、兩基因聯(lián)合突變發(fā)生率，CR

26、C中為54.0％(34/63)，AA中為40.4％(21/52);聯(lián)合檢測糞便DNAKRAS與TP53基因突變篩查CRC與AA的性能欠佳，敏感度分別為54％[95％CI0.41，0.66]與40％[95％CI0.27，0.55]，特異度均為97％[95％CI0.87，0.99]，準確性分別為75％與71％。
　　 結論：
　　 “學習集”階段
　　 1、在CRC與AA患者的組織樣本中，HRMA檢測KRAS外顯子2

27、-3與TP53外顯子5-8基因突變準確性與DNA測序結果完全一致，其敏感性與特異度均達100％。
　　 2、在其相應的糞便DNA樣本中，HRMA檢測KRAS外顯子2-3與TP53外顯子5-8基因突變準確性與DNA測序結果完全一致，其敏感性與特異度均達100％。
　　 3、糞便DNA突變檢出率與組織DNA突變檢測出率的符合率高度一致，Kappa值為0.794，在CRC、AA中分別為0.794、0.814。
　　 H

28、RMA的敏感性分析
　　 在野生型基因稀釋的背景下，這可粗略估計出HRMA檢測突變的敏感性能達1％稀釋濃度，并且發(fā)現(xiàn)待檢樣本的序列變異直接影響HRMA檢測的靈敏度，因此HRMA能穩(wěn)定可靠地檢出突變的敏感性是≥5％稀釋濃度。
　　 “驗證集”階段
　　 1、病例組基因突變檢出率(49.3％，37/75)顯著高于對照組(3.3％，2/60)。表明KRAS和/或TP53基因突變與大腸腫瘤性病變相關。
　　 2、

29、CRC患者基因突變檢出率的顯著高于AA患者，表明KRAS和/或TP53基因突變與CRC關系更密切。
　　 3、HRMA檢測基因突變的結果均能被隨后的測序所證實，其檢測糞便DNA突變的敏感度與特異度均達100％。
　　 糞便基因突變與臨床病理特征參數(shù)關系及臨床診斷價值
　　 1、在所有病例患者的糞便DNA樣本中，KRAS突變檢出率為26.1％(30/115)，TP53突變檢出率為21.7％(25/115);CRC、

30、AA原發(fā)于近端結直腸多于遠端結直腸;Duck's分期中，較早期病變(A+B期)明顯多于較晚期(C+D期);在病例組與對照組間、CRC亞組與AA亞組間，均存在顯著的性別差異，前者男性所占比例均明顯多于后者;同一基因的不同長度片段(155bp和92bp)對HRMA的突變檢出率無影響。
　　 2、病例組中，均未發(fā)現(xiàn)KRAS、TP53各基因突變頻率與性別、部位、分化度/異型增生度、組織類型、大小、Duke's分期、年齡存在相關性。