應(yīng)用高分辨熔解曲線系統(tǒng)檢測(cè)髓系腫瘤中基因突變及其臨床意義.pdf

1、目的：
　　 (1)應(yīng)用高分辨熔解曲線分析(HRMA)技術(shù)建立髓系腫瘤中相關(guān)基因(C-KIT、IDH1、IDH2、DNMT3A、U2AF1和JAK2)突變的分子診斷平臺(tái)。
　　 (2)探討這些基因突變的臨床意義。
　　 方法：
　　 (1)臨床病例收集、細(xì)胞分離及DNA提取：收集按FAB和WHO標(biāo)準(zhǔn)診斷的初診急性髓系白血病(AML)221例、骨髓增生異常綜合征(MDS)88例和骨髓增殖性腫瘤(MPN)14

2、2例骨髓標(biāo)本，用人淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-Hypaque)分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，DNA抽提試劑盒提取基因組DNA。
　　 (2)PCR擴(kuò)增：針對(duì)不同基因(包括C-KIT、IDH1、IDH2、DNMT3A、U2AF1和JAK2)的基因突變位點(diǎn)建立相應(yīng)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，在ABI7300 PCR擴(kuò)增儀上分別對(duì)這些基因進(jìn)行擴(kuò)增。
　　 (3)HRMA檢測(cè)：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在LightScanner分析儀上進(jìn)行熒光掃描，應(yīng)

3、用分析軟件進(jìn)行處理，分析HRMA檢測(cè)不同基因突變的靈敏度，并進(jìn)一步檢測(cè)待測(cè)標(biāo)本的基因突變情況。
　　 (4)DNA測(cè)序：首先評(píng)估DNA測(cè)序檢測(cè)不同基因突變的靈敏度，然后對(duì)HRMA掃描鑒定為突變的標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序。
　　 (5)突變的臨床意義分析：用Spearman秩和相關(guān)檢驗(yàn)進(jìn)行突變與性別、年齡、血液學(xué)參數(shù)、染色體分組、FAB分型、WHO分型等的相關(guān)性分析；應(yīng)用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切檢驗(yàn)對(duì)突變陽(yáng)性組和陰性組之間的分類(lèi)變量

4、(如性別、染色體分組、FAB分型和WHO分型等)進(jìn)行差異性比較，應(yīng)用Mann-Whitney U驗(yàn)對(duì)突變陽(yáng)性組和陰性組之間的連續(xù)變量(如年齡和血液學(xué)參數(shù)等)進(jìn)行差異性比較。應(yīng)用Kaplan-Meier和Cox分析分別對(duì)生存時(shí)間進(jìn)行單因素和多因素分析。
　　 結(jié)果：
　　 (1)C-KIT突變：①HRMA檢測(cè)C-KIT突變的靈敏度達(dá)5％，高于DNA測(cè)序的靈敏度(10％)；②對(duì)160例AML患者進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)9例(6％)存在C

5、-KIT基因突變，進(jìn)一步測(cè)序證實(shí)4例為D816V突變、4例為N822K突變、1例為D816H和N822K雙位點(diǎn)突變；9例C-KIT突變主要發(fā)生于FAB-M2亞型，其中7例患者伴有t(8；21)易位，2例患者為正常核型。在25例t(8；21)易位AML患者中，C-KIT突變發(fā)生率為28％，突變者與非突變者比較，兩組在性別、年齡、血象方面并無(wú)差異。
　　 (2)IDHI/IDH2突變：①HRMA檢測(cè)IDH1 R132H、IDH2 R

6、140Q和IDH2 R172K突變的靈敏度分別為5％、2％和5％，均高于DNA測(cè)序的靈敏度(10％)：②對(duì)198例AML患者的進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IDH1和IDH2突變發(fā)生率分別為2.0％(4例)和5.0％(10例)，均為雜合性突變、且均為單獨(dú)發(fā)生。IDH1突變包括3例R132H和1例R132S突變，IDH2突變包括7例R140Q和3例R172K突變。伴IDH1/IDH2突變的AML患者年齡明顯高于無(wú)突變者(P=0.002)。兩組患者在性別、

7、血細(xì)胞計(jì)數(shù)和FAB分型方面并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。染色體核型正常的AML患者中IDH1/IDH2突變率(12/85，14.1％)明顯高于核型異?；颊?2/99，2.0％)(P=0.004)。③82例MDS患者分別檢出2例(2.4％)和3例(3.6％)存在IDH1(R132H和R132S各1例)和IDH2突變(均為R140Q)。IDH1和IDH2突變均為雜合性、且均為單獨(dú)發(fā)生。伴或不伴IDH1/IDH2突變者在性別、年齡、血紅蛋白

8、含量和血小板計(jì)數(shù)方面并無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但伴突變者的白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于無(wú)突變者(P=0.010)。雖然全部突變均見(jiàn)于核型良好組，但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.407)。正常核型患者IDH1/IDH2突變率(5/52，9.6％)高于異常核型患者(0/30，0％)(P=0.153)。此外，根據(jù)IPSS分組，所有IDH突變均發(fā)生于低危組或中危-1組患者。多變量Cox分析揭示年齡和IPSS分組是MDS患者獨(dú)立的預(yù)后因素，而IDH1/ID

9、H2突變對(duì)生存時(shí)間并無(wú)影響。④85例慢性髓系白血病(CML)和57例Ph-MPN患者中均未檢測(cè)出IDH1/IDH2突變。
　　 (3)DNMT3A突變：①HRMA檢測(cè)DNMT3A R882H突變的靈敏度為2％，高于DNA測(cè)序的靈敏度(10％)；②182例AML患者中12例(6.6％)檢出DNMT3A突變，均為雜合性突變，包括8例R882H、3例R882C和1例R882P。R882突變與患者的性別和白細(xì)胞計(jì)數(shù)并無(wú)相關(guān)性，突變者年齡

10、高于無(wú)突變者、且突變者血小板計(jì)數(shù)明顯高于無(wú)突變者。DNMT3A R882突變更常見(jiàn)于單核類(lèi)AML(M4和M5，7/52例，13.4％)而非單核類(lèi)AML(M1、M2、M3和M6，5/130，3.8％)(P=0.041)。76例正常核型患者中10例(13.2％)存在R882突變，顯著高于核型異?；颊?2/92例，2.2％)(P=0.007)。③51例MDS患者檢出4例(7.8％)DNMT3A R882突變，均為雜合性，包括3例R882H和1

11、例R882C：伴或不伴DNMT3A突變者在年齡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)、WHO分型等方面并無(wú)顯著性差異；4例突變均發(fā)生于正常核型患者及IPSS中危組。伴突變者中位生存時(shí)間為9個(gè)月，而不伴突變者中位生存時(shí)間為25個(gè)月(P=0.047)。④79例CML和57例Ph-MPN患者中均未檢測(cè)出DNMT3A突變。
　　 (4)U2AF1突變：①HRMA檢U2AF1 S34和Q157突變的靈敏度均為5％，高于DNA測(cè)序的靈敏度(10％)；②221例AML

12、患者中4例(1.8％)檢出U2AF1突變，均為雜合性突變，包括2例S34Y和2例Q157(1例Q157P和1例Q157R)突變。突變患者與非突變患者在性別、年齡、血細(xì)胞、FAB分型和核型分組之間并無(wú)差異。伴U2AF1突變的患者生存時(shí)間明顯短于無(wú)突變者(中位時(shí)間分別為1和7個(gè)月，P=0.034)③88例MDS患者檢出4例(4.5％)S34突變，均為雜合性，包括3例S34F和1例S34Y。伴或不伴U2AF1突變者在性別、血細(xì)胞計(jì)數(shù)、WHO分

13、型和IPSS分組方面并無(wú)顯著性差異。伴U2AF1突變者年齡較無(wú)突變者年輕(P=0.059)。72例患者具有隨訪結(jié)果，突變患者和無(wú)突變患者在生存時(shí)間上并無(wú)顯著性差異(P=0.954)。④79例CML和57例Ph-MPN患者中均未檢測(cè)出U2AF1突變。
　　 (5)JAK2突變：①HRMA檢測(cè)JAK2 V617F突變的靈敏度為5％，高于DNA測(cè)序的靈敏度(10％)；②48例Ph-的MPN患者中，JAK2 V617F突變可見(jiàn)于3例(1

14、00％，均為雜合子突變)真性紅細(xì)胞增多癥(PV)、34例(60％，6例純合子突變、28例雜合子突變)原發(fā)性血小板增多癥(ET)和3例(60％，1例純合子突變、2例雜合子突變)原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)。而57例CML患者均為陰性。HRMA的檢測(cè)結(jié)果均經(jīng)直接測(cè)序證實(shí)。診斷的特異性和靈敏度均為100％。
　　 結(jié)論：
　　 (1)HRMA是檢測(cè)基因突變的一個(gè)高通量技術(shù)，其特異性好、靈敏度高、成本低廉，可有效用于對(duì)大批量標(biāo)本進(jìn)

15、行基因突變的篩選。
　　 (2)中國(guó)人群AML和MDS患者中存在IDH1和IDH2基因突變，均為雜合子突變，主要見(jiàn)于正常核型患者；IDH1/IDH2突變并非是MDS患者的不良預(yù)后因素。
　　 (3)DNMT3A R882突變是中國(guó)人群AML和MDS患者的一個(gè)常見(jiàn)分子事件，該突變均為雜合子突變，主要發(fā)生于正常核型患者；DNMT3AR882突變是MDS患者的一個(gè)不良預(yù)后因素。
　　 (4)中國(guó)人群AML和MDS中U2