中國男性不育患者CFTR基因突變檢測(cè)及其意義.pdf

1、前言
　　人類生存繁衍的基礎(chǔ)是生殖，生殖健康是人類健康的核心和社會(huì)文明進(jìn)步的標(biāo)志。不生育是影響男女雙方和家庭的全球性問題。目前全球大約有15％的夫婦受到不育的困擾，其中男方因素所致不少于50％，而他們當(dāng)中一半以上的患者病因不明。大量遺傳學(xué)與分子生物學(xué)的研究表明，除外傷以外，人類所有疾病幾乎均與基因有關(guān)。隨著人類基因組計(jì)劃項(xiàng)目的完成，人類基因的研究進(jìn)入后基因組時(shí)代，其科研成果迅速應(yīng)用于疾病的預(yù)防、診斷和治療。導(dǎo)致特發(fā)性無精子癥及嚴(yán)重

2、少弱精子癥的病因相當(dāng)復(fù)雜，推測(cè)其中最主要的因素是遺傳學(xué)改變。目前研究證實(shí)基因異常與不明原因的嚴(yán)重少精子和無精子密切相關(guān)，包括Y染色體微缺失、特定基因的突變或特定基因的多態(tài)性改變。為了從根本上實(shí)現(xiàn)對(duì)男性不育的診療，我們選定男性不育癥相關(guān)基因?yàn)橹饕芯糠较?。目前已知Y染色體微缺失可導(dǎo)致特發(fā)性無精子癥或嚴(yán)重少弱精子癥;CFTR基因突變與先天性雙側(cè)輸精管缺如(CBAVD)密切相關(guān)。先天性雙側(cè)輸精管缺如患者占到男性不育門診無精子癥病例的1-2％以

3、上，占到梗阻性無精子癥的25％?；颊叱杂X精液量少之外多無其他臨床表現(xiàn)，彩超多提示附睪網(wǎng)格狀回聲、附睪發(fā)育不良、雙側(cè)精囊腺發(fā)育不良，少數(shù)病例合并腎臟發(fā)育畸形、腎缺如。國外做了大量的CFTR基因突變與先天性雙側(cè)輸精管缺如關(guān)系的研究。發(fā)現(xiàn)已知的CFTR基因突變1900多種，并且還在不斷增加。發(fā)現(xiàn)先天性雙側(cè)輸精管缺如的患者中75％的病例至少存在1個(gè)CFTR基因突變。其中F508del、5T和R117H是最常見的突變。但是研究顯示，F(xiàn)508de

4、l這種高加索人最常見的突變?cè)趤喼奕酥袇s很少出現(xiàn)。不同地區(qū)、不同種族之間，突變發(fā)生的情況差異很大。目前尚缺乏在中國人群中的報(bào)道，中國生育力正常人群和男性不育癥患者CFTR基因突變情況尚不清楚。本研究以中國生育力正常男性和男性不育癥患者（先天性雙側(cè)輸精管缺如和非梗阻性無精子癥患者）為研究對(duì)象，檢測(cè)其CFTR基因M470V、TG-repeats、ploy-T以及CFTR基因全外顯子突變情況，以明確我國生育力正常男性和男性不育癥患者CFTR基因

5、突變和多態(tài)性分布情況及其臨床意義，為遺傳咨詢和進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的致病基因打下基礎(chǔ)。
　　材料和方法
　　一、實(shí)驗(yàn)材料
　　2008年至2012年間在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院和上海醫(yī)科大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院就診的95例先天性雙側(cè)輸精管缺如患者，入選標(biāo)準(zhǔn):①除原發(fā)不育外無其他囊性纖維化疾病癥狀;②體檢雙側(cè)睪丸體積正常，未觸及雙側(cè)輸精管;③三次精液常規(guī)檢查（離心沉淀鏡檢）均未見精子，排精后尿沉淀亦未見精子（排除逆行射精和不射精），精液

6、PH值呈酸性，精漿果糖及糖苷酶定量分析顯著低于正常;④生殖激素檢測(cè)及染色體檢查均正常;⑤附睪或睪丸穿刺取到精子。同期在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院就診的67例臨床診斷明確的非梗阻性無精子癥患者，入選標(biāo)準(zhǔn):①原發(fā)不育病史;②查體雙側(cè)睪丸體積正?；蛐∮谡＃ㄐ∮?2ml）;③三次精液常規(guī)檢查（離心沉淀鏡檢）均未見精子，排精后尿沉淀亦未見精子（排除逆行射精和不射精），精液PH值正常，精漿果糖及糖苷酶定量分析正常;④生殖激素檢測(cè)FSH正?；蛏撸ù?/p>

7、于12mU/ml），染色體檢查正常;⑤睪丸活檢病理Johnsen積分法評(píng)分2-8分。同時(shí)收集同期135例因女方因素?cái)M行試管嬰兒、精液常規(guī)檢查正常的生育力正常男性作為對(duì)照。以上病例經(jīng)知情同意后采集外周血2ml，EDTA抗凝，使用QIAGENBioRobotEZ1全自動(dòng)核酸提取工作站磁珠法抽提DNA，-20℃冰箱保存。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　1、使用Real-timePCR技術(shù)通過CyclingProbe法檢測(cè)基因組DNA標(biāo)本C

8、FTR基因外顯子10上M470V多態(tài)性分布情況，比較生育力正常男性、先天性雙側(cè)輸精管缺如患者以及非梗阻性無精子癥患者3組之間M470V基因型及等位基因的差異。
　　2、參考網(wǎng)站NCBIprime-blast，應(yīng)用軟件Primer5.0自行設(shè)計(jì)引物，對(duì)CFTR基因內(nèi)含子8的目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，從DNA測(cè)序結(jié)果直接分析TG-repeats、ploy-T多態(tài)性分布情況，比較生育力正常男性和先天性雙側(cè)輸精管缺如患者之間TG-rep

9、eats、ploy-T多態(tài)性分布差異。并與此前論文一的M470V檢測(cè)數(shù)據(jù)相結(jié)合，分析TG-repeats、ploy-T與M470V之間的關(guān)系。
　　3、參考文獻(xiàn)及網(wǎng)站NCBIprime-blast，應(yīng)用軟件Primer5.0自行設(shè)計(jì)CFTR基因全外顯子擴(kuò)增引物，對(duì)CFTR基因全外顯子進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用Chromasv1.62軟件分析并結(jié)合人工讀圖，參考http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/序

10、列，在網(wǎng)站http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/在線比對(duì)，對(duì)新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)在網(wǎng)站https://mutalyzer.nl/positionConverter在線分析。
　　結(jié)果
　　1、生育力正常男性、先天性雙側(cè)輸精管缺如患者以及非梗阻性無精子癥患者3組之間M470V基因型及等位基因分布的頻率無顯著性差異(P＞0.05)。MV基因型為最常見的基因型，在生育力正常男性人群中的基因型頻率為0.4296，其

11、次為VV基因型，基因型頻率為0.3704，最少見的為MM基因型，基因型頻率為0.2。MM、MV、VV基因型在生育力正常的男性人群中的分布符合哈迪-溫伯格平衡定律(P＞0.05)。V470等位基因?yàn)樯φ５哪行灾谐Ｒ姷牡任换?，等位基因頻率為0.5852，M470等位基因與V470等位基因在生育能力正常的男性人群中的分布比例約為0.7∶1。
　　2、先天性雙側(cè)輸精管缺如患者中T5等位基因的分布頻率為0.3202，而生育力正常男性

12、中為0.0340。生育力正常男性與先天性雙側(cè)輸精管缺如患者T5等位基因的分布頻率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)，T5與患者罹患先天性雙側(cè)輸精管缺如有關(guān)。所有包含TG13T5單倍體基因型和TG12T5純合體個(gè)體均表現(xiàn)為先天性雙側(cè)輸精管缺如。TG12為生育力正常男性人群中最常見的等位基因頻率。TG12T7為生育力正常男性中最常見的單倍體基因型。TG12T5-V470與患者罹患先天性雙側(cè)輸精管缺如有關(guān)。
　　3、對(duì)9例先天性雙側(cè)輸精管缺

13、如患者CFTR基因進(jìn)行全外顯子測(cè)序分析，在外顯子區(qū)新發(fā)現(xiàn)4種不同于國外已知突變類型的新型突變，均為錯(cuò)義突變，并經(jīng)網(wǎng)站http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/上報(bào)確認(rèn)。
　　結(jié)論
　　1、CFTR基因M470V多態(tài)性分布本身與中國男性不育癥患者罹患先天性雙側(cè)輸精管缺如或非梗阻性無精子癥無關(guān)。在生育力正常男性中M470與V470在生育力正常男性人群中分布比例約為0.7∶1，較歐洲人偏低。MM、M

14、V、VV基因型在中國生育力正常男性人群中的分布符合哈迪-溫伯格平衡定律。
　　2、中國CFTR基因T5多態(tài)性改變與患者罹患先天性雙側(cè)輸精管缺如有關(guān)。所有包含TG13T5單倍體基因型和TG12T5純合體個(gè)體均表現(xiàn)為先天性雙側(cè)輸精管缺如。TG13及TG12或與T5協(xié)同作用導(dǎo)致患者罹患先天性雙側(cè)輸精管缺如。TG12T5-V470單倍體基因型可能與患者罹患CBAVD有關(guān)。
　　3、中國先天性雙側(cè)輸精管缺如患者CFTR基因外顯子區(qū)存在