選擇性突變片段擴(kuò)增法在PIK3CA基因H1047R位點(diǎn)突變檢測中的應(yīng)用.pdf

1、目的：建立一種新型方法用于提高PIK3CA基因（H1047R位點(diǎn)）突變檢測敏感度。
　　方法：通過亞克隆技術(shù)構(gòu)建PIK3CA基因野生型DNA模板（含BseJI酶切位點(diǎn)）和突變型DNA模板。將PIK3CA基因野生型模板與突變型模板按照野生突變比（W:T）=100：1，300：1，1000：1的比例混合，并在高保真pfu DNA聚合酶的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得第一輪 PCR產(chǎn)物。利用限制性內(nèi)切酶 BseJI將 PCR產(chǎn)物酶切消化1h后

2、過柱純化，以2μ l酶切產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，過程中每10個循環(huán)加入BseJI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切消化1 h，最后對其產(chǎn)物進(jìn)行測序。
　　結(jié)果：我們成功地構(gòu)建帶有PIK3CA基因H1047R突變位點(diǎn)的突變型質(zhì)粒模板及其相應(yīng)的野生型質(zhì)粒模板。由于野生型片段包含限制性內(nèi)切酶B seJ I的酶切位點(diǎn)，在反應(yīng)過程中，PCR擴(kuò)增與反復(fù)的酶切消化聯(lián)合作用能夠選擇性地擴(kuò)增突變片段，而野生片段的擴(kuò)增則受到抑制。在眾多檢測PIK3CA基因H10