實(shí)時熒光PCR在基因分型與稀有突變檢測中的應(yīng)用.pdf

1、基因多態(tài)性是人類群體中的常見現(xiàn)象，這些差別可能在某些條件下導(dǎo)致人類疾病。快速、準(zhǔn)確地對基因多態(tài)性進(jìn)行檢測對于疾病預(yù)防與控制十分重要。腫瘤等疾病往往伴有多種體細(xì)胞突變，成為腫瘤監(jiān)測、預(yù)后等生物標(biāo)志，或靶向藥物的靶點(diǎn)以及反應(yīng)性標(biāo)志。不過體細(xì)胞突變一般是稀有突變，較難檢測，對檢測技術(shù)要求極高。本論文憑借實(shí)時PCR技術(shù)平臺，利用雙鏈熒光置換探針、ARMS引物、PAP引物、高分辨溶解曲線分析等不同策略，檢測不同的突變。論文前三章針對基因多態(tài)性檢測

2、，第四章針對稀有突變檢測。 第1章血小板血型抗原的基因分型本章利用熒光雙鏈置換探針，以臨床上6個主要的HPA系統(tǒng)的12個抗原為研究對象，建立相應(yīng)的基因分型方法。首先針對各個HPA系統(tǒng)建立了單重實(shí)時PCR，整個檢測過程僅需100min，具有特異性好、快速簡便的優(yōu)點(diǎn)。進(jìn)一步發(fā)展的3個四色實(shí)時PCR體系只需3個PCR管就能對6個HPA系統(tǒng)的12個等位基因同時進(jìn)行檢測，共用同一個PCR程序，使檢測更加簡便、高效。第一個四色實(shí)時PCR體系

3、能同時對HPA-1和-4進(jìn)行檢測；第二個四色實(shí)時PCR體系能同時對HPA-2和-3進(jìn)行檢測；第三個四色實(shí)時PCR體系能同時對HPA-5和-15進(jìn)行檢測。用所建立的四色實(shí)時PCR技術(shù)檢測了150份廈門健康獻(xiàn)血者樣品，結(jié)果與對照方法一致，并統(tǒng)計(jì)了廈門人群6個基因座位的基因頻率，與此前報(bào)道的中國人群基因頻率相近。 第2章ABO血型基因分型本章利用熒光雙鏈置換探針，以ABO血型系統(tǒng)為研究對象，建立相應(yīng)的基因分型方法。根據(jù)ABO基因結(jié)構(gòu)特

4、點(diǎn)，設(shè)計(jì)7條特異性雙鏈熒光置換探針分別檢測O1(261delG)，A(261G)，A(796C/803C)，B(796A/803C)，O2(802G＞A)，A2(1059delC)，A2(1009A＞G)，并建立單管或雙管兩種檢測模式。單管檢測模式可根據(jù)四種熒光信號的組合，判斷ABO血型的4個表型和6種基因型；雙管檢測模式可根據(jù)7個熒光探針產(chǎn)生的熒光信號變化組合，判斷ABO血型的15種基因型。單管檢測模式靈敏度可達(dá)160pg的基因組DN

5、A，在0.16～500ng范圍有良好的線性關(guān)系，對已知表型的110份樣品進(jìn)行了基因定型，并對134份樣品進(jìn)行了盲測。檢測結(jié)果與PCR-SSP檢測結(jié)果一致，與已知的血型表型基本一致。雙管檢測模式對已知表型的110份樣品進(jìn)行了檢測，檢測結(jié)果與PCR—SSP檢測結(jié)果一致。樣品中檢測到1份稀有的O1O1V—B樣品。單管檢測模式盲試中有1份與記錄的表型不符，后經(jīng)測序和PCR—SSP方法證明檢測結(jié)果正確。 第3章HLA—B27實(shí)時PCR檢測

6、本章利用熒光雙鏈置換探針，以與強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)的HLA—B27抗原為研究對象，建立相應(yīng)的基因檢測方法。反復(fù)比對了HLA—B基因座位所有等位基因外顯子2和3序列，選出B27相對保守又與其他B抗原基因差別較大的區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物和兩條特異性雙鏈熒光置換探針，涵蓋了所有已報(bào)道的35個亞型(截至2007年2月)。在體系中加入HGH基因檢測體系作為內(nèi)控，預(yù)示PCR反應(yīng)體系和DNA模板提取質(zhì)量，排除假陰性。對362份中國人的臨床樣品進(jìn)行了基因檢測

7、并與流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果進(jìn)行了比較。362份樣品中，359份樣品所得結(jié)果一致，3份不符，符合率為99％；流式檢測164份陽性，198份陰性；實(shí)時PCR檢測165份陽性，197份陰性。 第4章非小細(xì)胞肺癌吉非替尼藥物反應(yīng)性EGFR稀有突變檢測本章利用ARMS引物、雙鏈熒光PAP引物、高分辨熔解曲線分析、以及熒光雙鏈置換探針，以非小細(xì)胞肺癌吉非替尼藥物反應(yīng)性有關(guān)的29種EGFR突變?yōu)檠芯繉ο?，建立相?yīng)的4種檢測方法，相互比較每種方法的

8、檢測能力，選出檢測能力最佳成本最低的檢測方法，最后進(jìn)行臨床樣品的檢測。ARMS引物法對熱點(diǎn)突變等大多數(shù)突變可以檢測到0.1％，其他突變可以檢測到1％；雙鏈熒光PAP引物對3個熱點(diǎn)突變均可以檢測到0.1％，對19—M1可以檢測到0.01％；高分辨熔解曲線分析法對4個外顯子的29種突變中的23個能夠有效檢測，檢測能力在1～10％之間；熒光雙鏈置換探針法在對19種缺失突變檢測中，對19—M1的檢測能力可達(dá)到1％，對其他缺失突變檢測能力在5～1