突變敏感性開關檢測妊高壓相關基因AGT多態(tài)性研究.pdf

1、蘇州大學學位論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所提交的學位論文是本人在導師的指導下，獨立進行研究工作所取得的成果。除文中已經注明引用的內容外，本論文不含其他個人或集體已經發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不含為獲得蘇州大學或其它教育機構的學位證書而使用過的材料。對本文的研究作出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人承擔本聲明的法律責任。論文作者簽名：』年址日突變敏感性開關檢測妊高壓相關基因AGT多態(tài)性研究中文提要突變敏感性開關檢測妊高壓

2、相關基因AGT多態(tài)性研究中文提要目的：本文是研究用硫代磷酸酯修飾的堿基特異性引物結合高保真聚合酶所組成的突變敏感性分子“開／關“檢測AGT基因T174M和M235T的熱點突變。同時將該研究方法結合目前廣泛應用于臨床的熒光定量PCR技術，其特異性強，靈敏度高，全封閉等特點實現(xiàn)更理想分子診斷方法。方法：從數(shù)據(jù)庫中分析AGT的SNP(singlenucleotidepolymophism，單核苷酸多態(tài)1結合文獻中AGT高頻突變位點T174M和

3、M235T與妊娠高血壓的相關性。從人血液基因組中擴增兩個突變基因的DNA片段，將擴增產物與pMDl9T連接，轉化至EcoliTOPl0感受態(tài)細胞中，構建野生型載體質粒。用一種基因工程常用的細菌重組子的篩選方法篩選出正確克隆，用pMDl9T通用引物和DNA片段對應引物對挑選到的白色克隆用PCR方法鑒定，電泳結果中選出目標DNA經克隆測序以驗證是否是目標克隆，確認AGT基因野生型模板。采用重疊延伸PCR技術，對基因多態(tài)分析位置的堿基用PCR

4、單堿基突變，得到T174M和M235T兩個多態(tài)位點基因型DNA片段，定向克隆方法后的產物同樣用藍白斑篩選技術選出目標條帶，這些新構建的載體通過DNA測序確認。再以T174M和M235T為檢測位點，分別設計37末端野生型基因位點的引物及37末端硫化修飾突變引物；高保真DNA聚合酶介導的突變敏感性分子開關，檢測AGT基因野生型質粒模板和突變型質粒模板，瓊脂糖凝膠電泳成像結果分析。將該檢測方法應用于一般PCR和實時熒光定量PCR中可以檢測低至