油菜CAMTA1參與冷脅迫應答的功能研究.pdf

1、油菜（Brassicanapus）屬于十字花科，是一種重要的經(jīng)濟作物。低溫、干旱等非生物脅迫嚴重影響油菜的生長發(fā)育。因此，研究油菜的抗逆機制具有重要的科學意義和應用價值。本研究中，以先前分離鑒定的BnCaM1蛋白為誘餌，從油菜幼苗組織的酵母雙雜交cDNA文庫中分離鑒定了一個能夠與BnCaM1相互作用的互作蛋白，命名為BnCAMTA1，它是一種鈣調(diào)素結(jié)合蛋白，具有鈣調(diào)素結(jié)合位點，與鈣調(diào)素結(jié)合共同發(fā)揮作用。圍繞BnCAMTA1的功能研究，我

2、們做了以下工作:
　　 1.BnCaM1與BnCAMTA1相互作用的分析驗證
　　 我們以BnCaM1為誘餌蛋白，篩選了油菜幼苗組織的酵母雙雜交cDNA文庫，得到三個能夠與BnCaM1相互作用的蛋白，其中BnCAMTA1與BnCaM1的相互作用最強烈。利用回轉(zhuǎn)驗證實驗，證明在酵母細胞內(nèi)BnCAMTA1與BnCaM1能夠相互作用。
　　 2.BnCAMTA1基因的表達受冷脅迫誘導
　　 將7天齡油菜幼苗進行

3、4℃冷處理6h和12h，以未經(jīng)處理的油菜幼苗為對照。抽提油菜幼苗的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Real-timeRT-PCR分析了BnCAMTA1基因在冷脅迫條件下的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冷處理6h、12h下，BnCAMTA1的表達量明顯高于對照組，顯示BnCAMTA1的表達受到顯著誘導。
　　 3.BnCAMTA1蛋白主要定位于細胞核
　　 構(gòu)建了BnCAMTA1基因與eGFP（綠色熒光蛋白）基因的融合表達載體pBI121

4、-BnCAMTA1∶eGFP，轉(zhuǎn)化了擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因植株。在共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗根組織細胞的熒光定位，結(jié)果表明BnCAMTA1-eGFP熒光在植物根細胞的細胞核中及細胞膜上有很強的積累，說明BnCAMTA1屬于一類核蛋白。
　　 4.過量表達BnCAMTA1增強了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的冷耐受性和ABA敏感性
　　 構(gòu)建BnCAMTA1過量表達載體，導入擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因植株。選取表達量較高的轉(zhuǎn)基因株系，進行表

5、型分析。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥無論是在幼苗期，還是在成熟期，均增強對冷脅迫的耐受性。而且，分析表明，轉(zhuǎn)基因植株對ABA敏感。進一步分析表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株經(jīng)冷處理后，與冷脅迫及ABA信號相關(guān)的基因表達水平也發(fā)生了改變，說明BnCAMTA1蛋白可能參與了植物冷脅迫應答及ABA信號通路。
　　 5.BnCAMTA1能夠與AtCBF2啟動子相互作用
　　 在擬南芥中，AtCAMTA可以與AtCBF2啟動子中的CM順式元件