基于RNAi揭示BnTT1參與油菜種子發(fā)育與代謝的功能特征.pdf

1、油菜是世界上四大主要油料作物之一，屬于十字花科蕓薹屬。油菜3個栽培種之一的甘藍型油菜（2n=38，AACC）是遍及世界的重要油料作物，也是我國最大的油菜籽作物。在提高單產(chǎn)的同時提高油菜籽的含油量和品質(zhì)一直是當代油菜育種的核心目標，黃籽油菜較相同遺傳背景下的黑籽油菜有含油量高、種子種皮薄、色素雜質(zhì)少和菜油品質(zhì)好等優(yōu)點，因此油菜黃籽性狀是油菜育種中一個重要的育種目標。甘藍型油菜雖然是三種油菜栽培種中籽粒產(chǎn)量最高的種類，但缺乏天然的甘藍型油菜

2、黃籽材料。甘藍型油菜籽粒顏色與類黃酮生物合成這個次生代謝途徑高度相關(guān)，深入研究甘藍型油菜類黃酮途徑，不僅有助于深入理解甘藍型油菜種皮顏色的形成機制，而且對于甘藍型油菜黃籽育種目標具有重要意義。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、呸D(zhuǎn)基因甘藍型油菜4個株系生長發(fā)育較中雙10號野生正常株系遲緩，苗期的轉(zhuǎn)基因株矮小，且抽薹開花延遲，花后的轉(zhuǎn)基因株系可以正常授粉結(jié)籽，末花期的轉(zhuǎn)基因株能達到中雙10號正常株的株高，但分枝數(shù)減少。種子表型調(diào)查顯示轉(zhuǎn)基因

3、株系成熟種子呈黃色、籽粒小、千粒重低（平均下降了26.67%），種子顯微切片顯示轉(zhuǎn)基因株系發(fā)育中種子和成熟種子的種皮都變薄。
　?、茖Ω仕{型油菜的研究中，BnTT1基因家族的沉默抑制導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因油菜成熟種子呈現(xiàn)黃色并伴隨種子變小、千粒重下降和種皮變薄等一系列轉(zhuǎn)基因特征。對轉(zhuǎn)基因發(fā)育中種子的解剖觀察顯示轉(zhuǎn)基因發(fā)育中種子的內(nèi)種皮和外種皮都變薄，油菜內(nèi)種皮和外種皮的解剖顯示共有五層細胞層，一層表皮細胞層（表皮層）和三層?xùn)艡诩毎麑樱艡趯樱?/p>

4、構(gòu)成外種皮，一層內(nèi)皮細胞層（內(nèi)皮層）構(gòu)成內(nèi)種皮。在發(fā)育中種子的比較中，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因種子?xùn)艡趯拥募毎冃∽儽?，?dǎo)致轉(zhuǎn)基因種子?xùn)艡趯幼儽?，連同變薄的內(nèi)皮細胞層一起促成轉(zhuǎn)基因種子種皮變薄。這些結(jié)果表明，BnTT1基因家族可以影響油菜種子?xùn)艡诩毎麑雍蛢?nèi)皮細胞層的形態(tài)發(fā)育。同時，香草醛和TBO的染色結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因種子的種皮兒茶素和酚類化合物積累下降。RNA-seq比較分析顯示轉(zhuǎn)基因種子中大量參與類黃酮生物合成的基因表達發(fā)生了改變，同時，qRT-

5、PCR分析顯示轉(zhuǎn)基因種子中CHS/TT4、DFR/TT3、LDOX/TT18、ANR/BAN、TT12、 CFI/TT5、F3H/TT6和GSTF12/TT19等類黃酮生物合成與運輸相關(guān)的關(guān)鍵基因表達發(fā)生了顯著下調(diào)，作為這些類黃酮生物合成基因表達下調(diào)的后果，轉(zhuǎn)基因油菜種子類黃酮如表兒茶素、槲皮素及其衍生物(Qn-3-O-sophoroside, Qn-3-O-glucoside-1)、異鼠李素及其衍生物(Is-3-O-glucoside

6、, Is-3-O-glucoside-7-O-glucoside)、山萘酚衍生物(Km-3-O-glucoside-7-O-glucoside)、可溶性原花青素（原花青素B2[DP2]、[DP2]-2、[DP3]、[DP3]-2、[DP4]）和不溶性原花青素含量均顯著低于中雙10號對照種子，這些結(jié)果表明BnTT1基因家族調(diào)控類黃酮生物合成，BnTT1的功能缺失導(dǎo)致類黃酮合成與運輸一系列關(guān)鍵基因表達的下調(diào)，導(dǎo)致表兒茶素及其低聚物積累水平顯

7、著下降，最終促成轉(zhuǎn)基因種子的顏色變化。調(diào)查還顯示，在CHS/TT4，DFR/TT3，LDOX/TT18，ANR/BAN，TT12，CFI/TT5，F(xiàn)3H/TT6以及GSTF12/TT19等主要的類黃酮生物合成與運輸基因表達顯著下調(diào)的同時，一些類黃酮晚期生物合成基因如LAC15/TT10以及一些UGT（包括UGT73B3、UGT73B2、UGT73C5和 UGT73C1）的表達發(fā)生顯著上調(diào)，LAC15等基因表達雖然顯著上調(diào)，但是不溶性原花

8、青素水平還是下降了，表明原花青素前體物質(zhì)如表兒茶素的含量嚴重不足。以上成分分析和定量PCR證據(jù)共同表明，油菜BnTT1家族在調(diào)控種皮色素的同時也調(diào)控種胚黃酮醇積累，油菜BnTT1家族器官組織表達特異性分析顯示油菜TT1不僅在種皮中優(yōu)勢表達，而且在種胚中也顯著表達，意味著BnTT1基因家族可能直接參與調(diào)控油菜種胚的發(fā)育和代謝。另外，解剖觀察顯示油菜不僅內(nèi)種皮變薄，而且種皮的主要實體部分——柵欄層也變薄，暗示在甘藍型油菜中BnTT1不僅參與

9、內(nèi)種皮發(fā)育，對外種皮發(fā)育也有影響。
　?、荝NA-seq對比分析顯示轉(zhuǎn)基因系苯丙烷途徑基因表達譜發(fā)生了顯著改變，其中參與公共苯丙烷途徑的三個酶基因表達均發(fā)生了不同程度的下調(diào)，qRT-PCR分析顯示PAL、C4H和4CL基因總體表達均顯著下調(diào)，但各基因各員之間卻有著不同的表達模式，提示成員之間可能具有不同的功能分工，同時BnTT1基因家族的沉默對公共苯丙烷途徑基因表達的影響具有選擇性，如4CL基因家族成員中僅對參與類黃酮生物合成的4

10、CL3的表達造成影響，由此可以推測BnTT1選擇性調(diào)控參與類黃酮生物合成的基因成員。
　?、饶举|(zhì)素途徑是苯丙烷途徑的分支途徑，DEG分析顯示木質(zhì)素途徑基因表達譜明顯發(fā)生了變化，主要表現(xiàn)在β-葡糖苷酶基因家族和過氧物酶基因家族以及HCT、CAD、F5H1、UGT84A等基因，qRT-PCR調(diào)查顯示轉(zhuǎn)基因種子中C3H、CAD、CCoAOMT、F5H、F5H1和UGT84A等基因表達發(fā)生了輕微的上調(diào)，而COMT1、CCoAOMT1等基因

11、則發(fā)生了輕微的下調(diào)，總體上表現(xiàn)為上調(diào)，作為這些基因表達變化的影響，轉(zhuǎn)基因種子木質(zhì)素含量水平也發(fā)生輕微的變化，表現(xiàn)為一定程度但達到顯著水平的上升，表明BnTT1基因家族沉默對木質(zhì)素合成與代謝造成的影響較輕，有可能是類黃酮分支途徑物質(zhì)流的嚴重下降導(dǎo)致競爭性旁支途徑----木質(zhì)素途徑物質(zhì)流顯著增加，木質(zhì)素途徑基因表達相應(yīng)上調(diào)，種皮木質(zhì)素合成與積累含量上升。
　　⑸作為一類脂肪族羧酸，脂肪酸在植物種子中分布廣泛，在植物的整個生命周期發(fā)揮著

12、重要的作用。目前TT1在種子脂肪酸生物合成和代謝中所扮演的角色與功能仍然未知。在這項研究中，我們發(fā)現(xiàn)BnTT1基因家族的表達抑制導(dǎo)致脂肪酸組分發(fā)生顯著的改變，包括C18:1含量的下降（－12.41%）和C18:2、C18:3含量的增加（+30.08%，+25.59%），同時，總脂肪酸含量沒有明顯改變。伴隨著這種成分變化，編碼質(zhì)體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中脂肪酸生物合成關(guān)鍵酶的基因群表達譜表現(xiàn)出相應(yīng)的改變，包括ω-6脂肪酸去飽和酶基因FAD6、ω-3脂肪

13、酸去飽和酶基因FAD3和硬脂酰-ACP脫氫酶基因AACPD等基因。FAD6和FAD3基因表達的顯著上調(diào)，很可能分別是轉(zhuǎn)基因種子C18:2和C18:3脂肪酸明顯增加的原因。AACPD2、AACPD3和 AACPD5等基因小幅上調(diào)，則導(dǎo)致C18:0脂肪酸輕微上調(diào)。β-酮脂酰-ACP合成酶基因KASII表達的輕微下調(diào)，則可能是C16:0脂肪酸略微增加的原因。調(diào)查顯示轉(zhuǎn)基因種子總脂水平?jīng)]有明顯變化，相應(yīng)的，ACCase酶兩個同聚型基因ACC1、

14、ACC2及異聚型四個亞基基因表達均沒有變化。此外，在種子的成熟過程中調(diào)節(jié)脂肪酸生物合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因，B3結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子ABI3、核轉(zhuǎn)錄因子L1L和 LEC1表達顯著上調(diào)，因此推測BnTT1是ABI3、LEC1和L1L等脂肪酸生物合成調(diào)控基因的潛在調(diào)控子，BnTT1功能缺失導(dǎo)致ABI3、LEC1和L1L表達異常，進而改變了FAD6、FAD3、KASII和AACPD等基因的轉(zhuǎn)錄水平，最終導(dǎo)致脂肪酸組分和種子發(fā)育的改變。這些結(jié)果暗示油菜

15、TT1除調(diào)控類黃酮次生代謝外可能也參與種子脂肪酸初生代謝。
　?、兽D(zhuǎn)基因株系苗期到花期的生長發(fā)育調(diào)查顯示轉(zhuǎn)基因株系較中雙10號對照生長發(fā)育延遲，形態(tài)上發(fā)苗60d的轉(zhuǎn)基因植株明顯比同期的中雙10號對照矮小，抽薹開花也相應(yīng)延遲5-10d左右，成熟的轉(zhuǎn)基因植株在株形和株高上與中雙10號對照沒有顯著性差異，但分枝數(shù)減少，這些現(xiàn)象提示 BnTT1基因家族可能參與調(diào)控油菜植株的生長發(fā)育。但BnTT1基因器官組織表達特異性分析顯示BnTT1在油

16、菜營養(yǎng)器官根、莖、葉中并沒有表達，因此推測轉(zhuǎn)基因株系苗期生長發(fā)育遲緩并不是BnTT1基因家族被沉默后的直接影響，而且，轉(zhuǎn)基因各株系植株在生長發(fā)育的末期都可以達到中雙10號正常株的株高，此外，組培的轉(zhuǎn)基因T1代也未能觀測到這個表型差異，因此，我們推測，T2、T3代轉(zhuǎn)基因株系植株之所以生長發(fā)育較緩慢，很有可能是因為轉(zhuǎn)基因種子發(fā)育不良，轉(zhuǎn)基因種子籽粒顯著小于中雙10號正常種子，種子內(nèi)代謝組分如類黃酮物質(zhì)，尤其是黃酮醇水平大幅度下降，種子發(fā)育異