甲基化抑制劑對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞RUNX3及Cdc2L1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、[目的]
　　檢測空白組及實(shí)驗(yàn)組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中抑癌基因RUNX3及Cdc2L1啟動子區(qū)甲基化情況，觀察去甲基化藥物(5-氮雜-2'-脫氧胞苷)處理后檢測上述RUNX3及Cdc2L1的蛋白表達(dá)量及細(xì)胞增殖凋亡情況的影響，探討應(yīng)用去甲基化藥物治療瘢痕疙瘩的可行性。
　　[方法]
　　臨床上獲取經(jīng)臨床及病理確診的年齡在20-35歲之間女性耳廓背部瘢痕疙瘩組織標(biāo)本，患者術(shù)前未進(jìn)行任何物理及化學(xué)方法治療，進(jìn)行組織塊法瘢痕疙

2、瘩成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)。應(yīng)用第3-6代呈對數(shù)增殖期的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)，分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。應(yīng)用甲基化特異性PCR法(MSP法)檢測瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中抑癌基因RUNX3及Cdc2L1啟動子區(qū)是否存在甲基化，同法檢測實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用去甲基化藥物5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine，5-aza-dC)處理作用于細(xì)胞48小時(shí)后該組基因去甲基化情況;應(yīng)用免疫印跡法（Western blotting法）

3、檢測細(xì)胞中RUNX3和Cdc2L1蛋白表達(dá)量隨不同去甲基化藥物濃度作用后而引起的變化;應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（Annexin V）檢測空白組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡情況。
　　[結(jié)果]
　　組織塊法原代培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長情況良好，每瓶細(xì)胞數(shù)目(5×106)符合本實(shí)驗(yàn)要求。
　　(1)MSP結(jié)果顯示:RUNX3及Cdc2L1基因啟動子區(qū)CpG島存在異常甲基化。經(jīng)甲基化抑制劑5-aza-dC處理作用后，再經(jīng)MSP檢測基因啟動子區(qū)甲

4、基化出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。
　　(2)Western blotting結(jié)果顯示:經(jīng)過不同濃度甲基化抑制劑5-aza-dC作用細(xì)胞48小時(shí)后，檢測細(xì)胞中抑癌基因RUNX3及Cdc2L1的蛋白表達(dá)量隨藥物濃度增加而相應(yīng)出現(xiàn)遞增。
　　(3)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組加入5-aza-dC作用12小時(shí)后檢測細(xì)胞凋亡占總細(xì)胞數(shù)的20.38％，而空白對照組為0.42％。
　　[結(jié)論]
　　體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞與我們之