以RUNX3為靶點干預(yù)內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的研究.pdf

1、目的：
　　1.觀察轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）引起內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化及其與 Runt相關(guān)性轉(zhuǎn)錄因子3（Runx3）的關(guān)系。
　　2.觀察Runx3對內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響。
　　3.探討Runx3影響血管內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的相關(guān)機制。
　　方法：
　　1.將血管內(nèi)皮細(xì)胞分組：①Control組：普通培養(yǎng)液培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞6天；②1 ng/ml組：含1 ng/ml TGF-β1的普通培養(yǎng)液培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞6

2、天；③5 ng/ml組：含5 ng/ml TGF-β1的普通培養(yǎng)液培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞6天；④10 ng/ml組：含10 ng/ml TGF-β1的普通培養(yǎng)液培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞6天；⑤10 ng/ml+Runx3-siRNA病毒組：待病毒轉(zhuǎn)染72小時后，再加含10 ng/ml TGF-β1的普通培養(yǎng)液培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞6天。
　　2.應(yīng)用qRT-PCR法分別測定各組細(xì)胞 Runx3、血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子（CD31）、α平滑肌肌動蛋白（

3、α-SMA）、SNAILmRNA的表達；Western blot法測定各組細(xì)胞 Runx3、磷酸化蛋白激酶 B（p-AKT）、SNAIL，（內(nèi)皮型一氧化氮合酶）eNOS蛋白的表達并比較。同時運用ELISA檢測試劑盒檢驗（血管內(nèi)皮生長因子）VEGF。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建Runx3-siRNA慢病毒載體，病毒感染72h，感染復(fù)數(shù)（MOI）=30時，病毒轉(zhuǎn)染效率最強。
　　2. qRT-PCR法檢測各組細(xì)胞CD31

4、mRNA、α-SMA mRNA、SNAILmRNA、Runx3mRNA表達，結(jié)果顯示：與Control組相比，添加1ng/ml TGF-β1組血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31mRNA表達下調(diào)（P<0.05）、α-SMAmRNA表達上調(diào)（P<0.05）、SNAILmRNA表達上調(diào)（P<0.05）、Runx3mRNA表達上調(diào)（P<0.05）；添加5ng/ml TGF-β1組血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31mRNA表達下調(diào)（P<0.05）、α-SMAmRNA表達上調(diào)

5、（P<0.05）、SNAILmRNA表達上調(diào)（P<0.05）、Runx3mRNA表達上調(diào)（P<0.01）；添加10ng/ml TGF-β1組血管內(nèi)皮細(xì)胞 CD31mRNA表達下調(diào)（P<0.05）、α-SMAmRNA表達上調(diào)（P<0.05）、SNAILmRNA表達上調(diào)（P<0.01）、Runx3mRNA表達上調(diào)（P<0.01）。
　　與10ng/ml TGF-β1組相比，添加 Runx3-siRNA病毒相應(yīng)組血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31mR

6、NA表達上調(diào)（P<0.05）、α-SMAmRNA表達下調(diào)（P<0.05）、SNAILmRNA表達下調(diào)（P<0.05）、Runx3mRNA表達下調(diào)（P<0.05）。
　　3. Western blot法檢測各組細(xì)胞Runx3、SNAIL、eNOS、p-AKT蛋白表達，結(jié)果顯示：與Control組相比，添加1ng/ml TGF-β1組血管內(nèi)皮細(xì)胞Runx3表達上調(diào)（P<0.05）、SNAIL表達上調(diào)（P<0.05）、eNOS表達下調(diào)（

7、P<0.05）、p-AKT表達上調(diào)（P<0.05）；添加5ng/ml TGF-β1組血管內(nèi)皮細(xì)胞 Runx3表達上調(diào)（P<0.01）、SNAIL表達上調(diào)（P<0.05）、eNOS表達下調(diào)（P<0.05）、p-AKT表達上調(diào)（P<0.05）；添加10ng/ml TGF-β1組血管內(nèi)皮細(xì)胞Runx3表達上上調(diào)（P<0.01）、SNAIL表達上調(diào)（P<0.01）、eNOS表達下調(diào)（P<0.05）、p-AKT表達上調(diào)（P<0.05）。
　

8、　與10ng/ml TGF-β1組相比，添加 Runx3-siRNA病毒相應(yīng)組血管內(nèi)皮細(xì)胞Runx3表達下調(diào)（P<0.01）、SNAIL表達下調(diào)（P<0.01）、eNOS表達上調(diào)（P<0.01）、p-AKT表達上調(diào)（P<0.01）。
　　4. ELISA檢測試劑盒檢驗VEGF表達，結(jié)果顯示：與Control組相比，添加1ng/ml TGF-β1組血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達上調(diào)（P<0.05）；添加5ng/ml TGF-β1組血管內(nèi)皮

9、細(xì)胞VEGF表達上調(diào)（P<0.05）；添加10ng/ml TGF-β1組血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達上調(diào)（P<0.05）。與10ng/ml TGF-β1組相比，添加Runx3-siRNA病毒相應(yīng)組血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達上調(diào)（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. TGF-β1可以引起血管內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，Runx3參與其中。
　　2.下調(diào)Runx3的表達能夠減輕內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。
　　3.下調(diào)Runx3的表達能夠降