以CVB3-3C為靶點的藥物篩選和結晶學研究.pdf

1、目前，病毒性心肌炎嚴重危害人類健康，抗病毒性心肌炎藥物的設計和篩選對治療該病尤為重要。B3型柯薩奇病毒(CVB3)是引起人類病毒性心肌炎最主要的病原體，其基因組只有一個開放閱讀框，編碼形成4個病毒衣殼蛋白(VP1～VP4)和7個非結構蛋白(2A～2C、3A～3D)。其中3C蛋白是柯薩奇病毒的一種自身水解蛋白酶，主要負責對大多數前體蛋白進行剪切，形成成熟蛋白，同時它對病毒RNA的復制，蛋白引物的形成也至關重要，對病毒的繁殖擴增極其重要，被

2、認為是抗病毒藥物設計的一個重要靶點。
　　本論文首先使用原核表達體系實現CVB3-3C蛋白酶體外重組表達，依次經Ni-NTA親和層析、陰離子交換層析和凝膠排阻層析，獲得高純度CVB3-3C蛋白。為了實現針對CVB3-3C蛋白的藥物篩選，我們通過優(yōu)化實驗確定了CVB3-3C蛋白藥物篩選所需的緩沖液的類型、鹽離子濃度及pH，并對體系中蛋白酶濃度、底物濃度及CVB3-3C蛋白酶對DMSO耐受濃度進行了優(yōu)化;同時，進一步對體系的穩(wěn)定性、可

3、靠性進行分析評價，建立起一套完整的CVB3-3C蛋白藥物篩選體系。利用該體系對2000多種化合物進行了篩選，共得到12種抑制率超過80％的化合物。其中6種化合物抑制效果較好，分別為:MDCE-10a IC50為36.70μmol/L，MDCE-10c IC50為33.25μmol/L, MDCE-10e IC50為21.07μmol/L, MDCE-A008 IC50為60.60μmol/ L,MDCE-A022 IC50為23.55μ

4、mol/L，MDCE-A043 IC50為105.70μmol/L。用篩選得到的化合物與CVB3-3C蛋白酶進行共晶實驗和藥物浸泡實驗，獲得CVB3-3C蛋白酶與抑制劑的復合物晶體。利用X-衍射技術對復合物晶體進行分析，獲得了CVB3-3C蛋白酶與化合物MDCE-A008的復合物晶體，分辨率為2.4(A)。
　　本論文在分子水平上建立起以CVB3-3C為靶點的藥物篩選體系，并應用該體系篩選有效抑制劑，作為抗CVB3藥物的目標化合物