以DXS和DXR為靶點(diǎn)的新型抗弧菌藥物高通量篩選模型的建立與應(yīng)用.pdf

1、弧菌病是水產(chǎn)動物最主要的細(xì)菌病之一，其爆發(fā)性強(qiáng)，死亡率高，每年給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。目前細(xì)菌性病害的防治主要依靠抗生素及化學(xué)藥物。然而，抗生素的大量盲目地使用，導(dǎo)致了耐藥性菌株不斷出現(xiàn)，使病害更加難以控制，因此需要不斷地尋找新的、安全的抗菌藥物。
　　類異戊二烯是弧菌合成細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)單元肽聚糖的骨架分子，也是參與能量代謝等多種生物過程的十分重要的生理活性物質(zhì)。生物體內(nèi)的類異戊二烯類化合物主要有兩種生物合成途徑:甲羥戊酸(

2、MVA)途徑和2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑，其中MEP途徑廣泛存在于大多數(shù)細(xì)菌、藻類、地衣及高等植物中，但目前該途徑尚未在人體和動物體中發(fā)現(xiàn)，因此MEP途徑的關(guān)鍵酶1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)成為潛在的、具有較好選擇毒性的抗弧菌藥物的分子靶點(diǎn)。
　　本研究以創(chuàng)傷弧菌MEP途徑中的關(guān)鍵酶DXS及DXR為研究對象，通過分子生物學(xué)方法，構(gòu)建了創(chuàng)傷弧菌D

3、XS和DXR蛋白的表達(dá)載體;優(yōu)化了蛋白的表達(dá)條件，獲得了可溶性表達(dá)的VvDXS和VvDXR蛋白;采用親和層析法對表達(dá)產(chǎn)物VvDXS和VvDXR進(jìn)行了純化，獲得了兩個具有天然酶活性的可溶性蛋白;建立了VvDXS和VvDXR的酶活測定體系，并對反應(yīng)溫度、緩沖液pH、底物濃度、反應(yīng)酶量等條件進(jìn)行了優(yōu)化;在上述基礎(chǔ)上建立了VvDXR抑制劑的篩選體系，構(gòu)建了靶向VvDXS和VvDXR的VvDXS-VvDXR抑制劑高通量篩選模型并評價了模型的可行性