以BMP2為靶點(diǎn)的新型抗骨質(zhì)疏松藥物篩選模型的構(gòu)建與應(yīng)用研究.pdf

1、骨形態(tài)形成蛋白Ⅱ(BMP2)是TGF-β超家族成員之一，它在成骨細(xì)胞中高度表達(dá)，是體內(nèi)外成骨細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因子。大量研究表明，BMP2能夠高效地誘導(dǎo)骨形成，有望成為骨損失伴隨性疾病，特別是發(fā)生在絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松等疾病的新的治療靶點(diǎn)。 為了尋找能夠提高BMP2表達(dá)水平的活性化合物，本工作構(gòu)建了一個(gè)可用于高通量篩選的細(xì)胞水平穩(wěn)定轉(zhuǎn)染模型。將包含小鼠bmp2啟動(dòng)子和熒光素酶報(bào)告基因的報(bào)告質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至小鼠顱骨細(xì)胞MC3

2、T3—E1細(xì)胞，完成模型構(gòu)建，并用已知的BMP2上調(diào)劑進(jìn)行模型驗(yàn)證和條件優(yōu)化。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道所選的BMP2上調(diào)劑在此模型上都呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系和較高的信噪比，證明模型具有良好的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性。應(yīng)用本模型對(duì)3192個(gè)天然產(chǎn)物與合成化合物進(jìn)行了篩選，經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩，獲得了7個(gè)具有bmp2啟動(dòng)子上調(diào)活性的陽(yáng)性化合物。穩(wěn)定性參數(shù)Z’因子>0.5，適用于高通量篩選的要求。 對(duì)篩選得到的活性化合物，選擇大豆甙元、刺芒柄花素和2—乙酰苯

3、并噻吩進(jìn)行了分子藥理學(xué)及細(xì)胞水平生物活性研究。結(jié)果表明，3個(gè)化合物都能在微摩爾濃度下上調(diào)BMP2表達(dá)，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)方法在mRNA和蛋白水平證實(shí)了3個(gè)化合物對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞MG63中BMP2表達(dá)的上調(diào)作用。對(duì)2—乙酰苯并噻吩進(jìn)行了體外細(xì)胞增殖抑制作用檢測(cè)和堿性磷酸酶(AKP)水平檢測(cè)，結(jié)果表明，該化合物毒性較低，能夠上調(diào)骨形成標(biāo)志蛋白AKP活性。對(duì)以2—乙酰苯并噻吩為母核設(shè)計(jì)合成的76個(gè)衍生物，進(jìn)行了活性評(píng)價(jià)，并選擇