以CHOP為靶點的新型抗腫瘤藥物的高通量篩選及機制研究.pdf

1、研究目的：核轉(zhuǎn)錄因子CHOP作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中具有代表性的蛋白可通過過量表達(dá)促使細(xì)胞分化或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是調(diào)節(jié)細(xì)胞機能和命運的關(guān)鍵信號分子。近年來，研究發(fā)現(xiàn)CHOP與腫瘤的增殖、凋亡以及耐藥性的產(chǎn)生有密切關(guān)系。本課題旨在建立以CHOP為靶點的藥物篩選模型，并利用這一模型對化合物庫進行隨機篩選，得到一系列活性化合物，并進一步研究其抗腫瘤作用的分子機制，為針對CHOP的藥物研發(fā)提供依據(jù)。
　　 研究方法：1)構(gòu)建含有CHOP啟動子控制的報

2、告基因質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染并篩選得到穩(wěn)定細(xì)胞株，建立高通量篩選模型，篩選得到活性良好的化合物；并用MTT檢測篩選得到的化合物對多株腫瘤細(xì)胞的抑制增殖作用。2)考察LGH00168和其他化合物的合用效果。3)用移植瘤裸鼠模型評價了LGH00168的體內(nèi)效用。4)選用人官頸癌細(xì)胞Hela為研究對象，以篩選得到的化合物L(fēng)GH00168處理，來評價化合物抑制Hela細(xì)胞增殖的具體作用機制。采用Hoechst染色觀察細(xì)胞核形態(tài)；細(xì)胞經(jīng)碘化丙錠(PI)染色后

3、采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡的變化情況；采用Western blot檢測細(xì)胞CHOP與其相關(guān)蛋白的表達(dá)變化；應(yīng)用RT-PCR觀察XBP-1的轉(zhuǎn)錄后修飾；siRNA沉默CHOP從而考察化合物在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中對CHOP通路的依賴性。5)用熒光素酶檢測化合物對CHOP啟動子不同區(qū)段的激活情況，Western Blot檢測相關(guān)上游通路蛋白的表達(dá)，考察CHOP激活的具體機制。
　　 研究結(jié)果：1)構(gòu)建含有CHOP啟動子的報告基因質(zhì)粒pG

4、L3-CHOP，將它轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞建立穩(wěn)定細(xì)胞株HEK293/CHOP，用其建立高通量篩選模型，Z’>0.5。2)通過高通量篩選模型發(fā)現(xiàn)數(shù)個可顯著激活CHOP啟動子的化合物，激活倍數(shù)大于2倍SD值，且呈劑量依賴關(guān)系。MTT檢測結(jié)果表明，這些化合物具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果，其IC50<10μg/ml。3)LGH00168和多個化合物合用，都有較好的抑制腫瘤增殖的效果，和紫杉醇合用最佳。4)在移植瘤裸鼠模型實驗中，化合物L(fēng)GH001

5、68顯示了較好的抑制腫瘤生長作用，抑瘤率為36.1％。5)Hoechst染色觀察發(fā)現(xiàn)20μMGH00168可以顯著引起Hela細(xì)胞核固縮及凋亡小體的產(chǎn)生，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示隨著作用時間增加凋亡細(xì)胞的數(shù)量增多。通過Western blot技術(shù)檢測相關(guān)凋亡蛋白，發(fā)現(xiàn)LGH00168能顯著上調(diào)CHOP蛋白的表達(dá)，抑制Bcl2蛋白的表達(dá)，引起caspase3和PARP的裂解；應(yīng)用siRNA敲除CHOP后LGH00168引起的細(xì)胞凋亡受到抑制，約

6、下降了50％，顯示LGH00168通過激活CHOP相關(guān)通路誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的凋亡進而引起細(xì)胞增殖抑制。6)用熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn)LGH00168是通過激活CHOP啟動子上的AARE1和AP1區(qū)段從而激活CHOP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)的，Western blot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)LGH00168能引起其上游蛋白JNK、c-JUN、eIF2α的磷酸化，從而引起AARE1和AP1的激活。
　　 結(jié)論：通過高通量篩選得到的化合物對CHOP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)具有明顯的

7、上調(diào)作用，并依賴于CHOP通路發(fā)揮其誘導(dǎo)凋亡的作用。藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)該類化合物具有對腫瘤細(xì)胞體內(nèi)和體外的抑制增殖作用，顯示以CHOP作為靶點開發(fā)新型抗腫瘤藥物的可行性。進一步藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)化合物L(fēng)GH00168能夠通過eIF2α-ATF4通路和JNK-c-JUN通路激活CHOP啟動子中的AARE1和AP1區(qū)域激活CHOP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而引起其下游信號蛋白Bc12的表達(dá)量下降，進而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些數(shù)據(jù)揭示了該類化合物的可能作用機制，暗示C