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文檔簡介
1、目的:FGF2和FGFR1與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。FGFR1是肺鱗癌重要驅(qū)動基因之一,大約20%的肺鱗癌患者存在FGFR1基因擴(kuò)增,拮抗FGFR1成為肺鱗癌治療的重要靶點(diǎn)。FGFR1胞外段可通過與細(xì)胞膜上受體競爭配體來調(diào)節(jié)FGFs與FGFR1的相互作用。因此,本課題構(gòu)建了FGFR1胞外D1-D2-D3段加載免疫球蛋白IgG恒定區(qū)Fc段的融合蛋白,在藥物設(shè)計(jì)方面,研究了蛋白質(zhì)的合成,陽性NS/0細(xì)胞的篩選,無血清馴化以及目的蛋白的分
2、離純化等方法。在體外,從抑制細(xì)胞生長,周期進(jìn)程,新生血管生成,細(xì)胞侵襲與遷移,細(xì)胞內(nèi)信號分子活化,以及干擾FGFR1表達(dá)幾個方面解析了FGFR1-Fc融合蛋白抗肺鱗癌的作用機(jī)制。
方法:
1.FGFR1-Fc融合蛋白的合成,表達(dá),純化以及親和性的研究
將編碼了人FGFR1胞外序列和人IgG1 Fc片段的重組質(zhì)粒以電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化入NS/0雜交瘤細(xì)胞中,利用選擇性培養(yǎng)基篩選陽性細(xì)胞,克隆出可以表達(dá)FGFR1-Fc
3、融合蛋白的細(xì)胞株。之后采用降低培養(yǎng)基血清濃度的方法馴化NS/0細(xì)胞,ProteinA柱層析法分離純化目的蛋白,ELISA方法檢測FGFR1-Fc與FGFs的親和力。
2.FGFR1-Fc融合蛋白的抗肺鱗癌機(jī)制的研究
首先利用Western blotting,PCR驗(yàn)證不同肺鱗癌細(xì)胞系中FGF2與FGFR1之間的關(guān)系。之后利用MTT法檢測FGFR1-Fc融合蛋白對FGFR1高表達(dá)肺鱗癌細(xì)胞株的增殖作用;流式細(xì)胞術(shù)分析F
4、GFR1-Fc對細(xì)胞周期調(diào)控的作用;Transwell方法分析藥物對腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響;CAM模型分析FGFR1-Fc對新生血管生成的作用;Western blotting解析藥物對FGF2/FGFR1信號通路相關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化水平的影響;最后,通過干擾FGFR1表達(dá)反向驗(yàn)證FGFR1-Fc抗肺鱗癌的作用靶點(diǎn)。
結(jié)果:
1.FGFR1-Fc融合蛋白的合成,表達(dá),純化以及親和性的研究
pN24/FGFR
5、1-Fc質(zhì)??梢院铣晒劝滨0泛铣擅?,因此利用不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基篩選出成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的的NS/0雜交瘤細(xì)胞,之后通過逐步降低血清含量來馴化細(xì)胞,最終得到能夠在不含血清的選擇性培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長傳代并表達(dá)蛋白的NS/0細(xì)胞株。利用Protein A親和層析柱分離可從1L培養(yǎng)基上清中得到含量高達(dá)400mg的目的蛋白,純度為95%。體外的ELISA結(jié)果證明FGFR1-Fc與FGF-2具有高親和性。
2.FGFR1-Fc融合蛋白的抗肺鱗癌
6、機(jī)制的研究
FGFR1-Fc可有效拮抗FGFR1高表達(dá)肺鱗癌細(xì)胞系的增殖,使大量細(xì)胞阻滯在G0/G1期,且可有效抑制肺鱗癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)FGFR1-Fc明顯抑制新生血管生成,抑制效果與計(jì)量成正比。除此之外,F(xiàn)GFR1-Fc可有效下調(diào)FGF2/FGFR1信號通路中相關(guān)蛋白的活化。最后小分子RNA干擾實(shí)驗(yàn)可知FGFR1-Fc對FGFR1干擾細(xì)胞無作用。
結(jié)論:
本實(shí)驗(yàn)完成了FGF
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