以乳腺癌干細(xì)胞為靶點(diǎn)的高通量篩選抗腫瘤藥物方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、目的：全球乳腺癌發(fā)病率自20世紀(jì)70年代末開始逐漸上升，并體現(xiàn)出年輕化趨勢(shì)，它是威脅女性身心健康的常見腫瘤，是致使女性死亡的重要因素。目前雖然開發(fā)了很多化療藥物，醫(yī)療水平也逐漸提高，對(duì)人類做出了重大貢獻(xiàn)，但也只有少數(shù)的病人能夠得到有效的治療，絕大多數(shù)乳腺癌惡化、復(fù)發(fā)的現(xiàn)象仍不可避免。很多科學(xué)家認(rèn)為―腫瘤起源于腫瘤干細(xì)胞‖，腫瘤干細(xì)胞是指具有干細(xì)胞性質(zhì)的腫瘤細(xì)胞，也就是具有自我更新、高致癌性、多細(xì)胞分化等能力。癌干細(xì)胞存在于癌細(xì)胞中，是癌

2、癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的"元兇"，擁有重建腫瘤組織和放化療抵抗的能力，導(dǎo)致腫瘤治療失敗，從而發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。所以研究出針對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的療法，能夠?qū)Ｒ恍缘臍⑺腊┌Y干細(xì)胞，以降低腫瘤產(chǎn)生抗藥性或轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，對(duì)人類將有重要意義。隨著對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的深入研究，人們已經(jīng)能夠根據(jù)乳腺癌干細(xì)胞表面的分子標(biāo)志物的表達(dá)如 PROCR，ABCG2， ALDH1等，用流式分選術(shù)將其分選出來，并發(fā)現(xiàn)它們?cè)跓o血清低吸附培養(yǎng)條件下能夠形成乳腺微球，富集乳腺癌干細(xì)胞。斑

3、馬魚的基因序列識(shí)別顯示與82％的人類疾病具有同源性，是近年來一個(gè)通用的研究癌癥的模型。它具有胚胎多易得到成本低，能充分模擬腫瘤細(xì)胞侵入血管，隨著血流發(fā)生遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移能力等優(yōu)點(diǎn)，為高通量篩選藥物提供了良好的異體移植模型。
　　方法：以乳腺癌細(xì)胞系微球培養(yǎng)和斑馬魚異體移植為研究模型，篩選對(duì)象來自美國藥品收集庫，包含1280種 FDA認(rèn)證的藥物，所有的藥物以10 mM濃度溶解在DMSO里。本實(shí)驗(yàn)分三個(gè)部分篩選抑制乳腺癌干細(xì)胞的藥物。建立篩

4、選藥物的模型，用已知對(duì)乳腺癌癌干細(xì)胞有抑制作用的鹽霉素作陽性藥物，選取分別代表 ER-PR-Her2-，ER+PR+Her2-，ER-PR-Her2+的MDA-MB-231，MCF-7，SKBR3細(xì)胞系進(jìn)行乳腺微球培養(yǎng)和斑馬魚顯微注射，每個(gè)細(xì)胞系分兩組：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。微球培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)里鹽霉素暴露于無血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，斑馬魚顯微注射實(shí)驗(yàn)里鹽霉素暴露于胚胎培養(yǎng)液。體外初篩實(shí)驗(yàn)，以10μM的濃度篩選出能明顯抑制 MDA-MB-231， MCF-

5、7， SKBR3細(xì)胞系乳腺微球形成的藥物，篩選出的藥物再做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。斑馬魚顯微注射實(shí)驗(yàn)，三種乳腺癌細(xì)胞系分別用癌干細(xì)胞標(biāo)志物 PROCR， ABCG2，ALDH1通過流式分選技術(shù)分選出癌干細(xì)胞，標(biāo)記熒光示蹤染料 CM-DIL后顯微注射到48 hpf的斑馬魚卵黃周里，注射24 h后用熒光顯微鏡拍照并暴露藥物，注射72 h再拍照，到注射96 h觀察癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況。
　　結(jié)果：鹽霉素作為陽性藥物抑制了乳腺癌干細(xì)胞的微球形成、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

6、，驗(yàn)證了藥物篩選模型的可行性。體外實(shí)驗(yàn)從1280種藥里篩選出163(12.7%)種明顯抑制微球形成的藥物，三個(gè)細(xì)胞系 MDA-MB-231，MCF-7，SKBR3分別篩出109，141，88(8.5%，11.0%，6.9%)種，對(duì)三種細(xì)胞都有抑制作用的有59（4.6%）種。進(jìn)行顯微注射斑馬魚并暴露59種藥，對(duì) MDA-MB-231，MCF-7細(xì)胞系里 PROCR+，ABCG2+群有抑制作用的分別有20，18種，對(duì)兩種都有效的有10種。對(duì)

7、這10種藥物用第三個(gè)細(xì)胞系 SKBR3分選出 ALDH1+群進(jìn)行顯微注射，篩選出7種藥物有效，分別為替尼泊苷、洋地黃毒苷、吐根堿、氟尿苷、滅締靈、司拉克丁、嘌呤霉素。
　　結(jié)論：乳腺微球培養(yǎng)和斑馬魚顯微注射是有效評(píng)價(jià)乳腺癌干細(xì)胞自我更新、無限增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力的模型。實(shí)驗(yàn)篩選出了7種藥物能夠抑制分別代表 ER-PR-Her2-，ER+PR+Her2-，ER-PR-Her2+的MDA-MB-231，MCF-7，SKBR3細(xì)胞系里乳腺