基于穿透肽技術(shù)的高通量多肽藥物篩選系統(tǒng)的建立.pdf

1、炎癥(inflammation)是一種廣泛的病理生理反應(yīng)，參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，如膿毒血癥、系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征、缺血再灌注損傷等常常伴隨劇烈的急性炎癥反應(yīng)。慢性炎癥是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性骨病、慢性炎性腸病、脂肪沉積性動脈粥樣硬化、以及某些癌癥的主要病因。積極治療和控制炎癥是多種疾病治愈的關(guān)鍵。目前，有許多針對炎癥治療的生物制劑，如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、白細胞介素-1(interleukin-1，IL

2、-1)和腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-alpha，TNF-α)的特異性抗體、自由基清除劑、蛋白酶抑制劑、黏附分子抗體等，這些藥物雖然在細胞和動物實驗中取得了一定療效，但臨床應(yīng)用都未達到理想療效。因此，當(dāng)前迫切需要尋找和研制更加有效的治療炎癥的藥物。 炎癥的一個重要特征是其發(fā)生和發(fā)展過程中會激活大量炎癥相關(guān)因子基因的表達，如趨化因子、黏附分子、細胞因子、蛋白酶、環(huán)氧合酶(cyclooxygenases，

3、COX)和一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)等。細菌的代謝產(chǎn)物L(fēng)PS以及主要的致炎細胞因子(IL-1，TNF-α)作用于機體細胞時，通過細胞表面特異性受體的介導(dǎo)可將信號傳遞入細胞內(nèi)，通過調(diào)節(jié)炎癥過程中眾多基因的表達，引發(fā)大量炎性因子的釋放。雖然激活釋放的炎性因子的數(shù)量非常龐大，但是在激活炎性因子基因表達過程中的上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路卻是相對有限的，所以，這就提示我們?nèi)绻槍@些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的特定信號分子為藥物靶點

4、，通過調(diào)節(jié)它們的活性來抑制炎性基因的表達，就可以有效的控制炎癥的發(fā)生和發(fā)展。 在生物體內(nèi)調(diào)節(jié)某一生物大分子功能活性的方式有很多種，但最有效的途徑是通過直接干預(yù)其基因表達的過程。基因表達調(diào)控的基本形式是通過蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用來實現(xiàn)，而蛋白質(zhì)的作用往往是由組成其結(jié)構(gòu)的多肽的功能來體現(xiàn)。因此，近年來利用功能性多肽模擬蛋白質(zhì)的功能作為藥物進行治療成為一種新趨勢。 我們設(shè)想在體外將一些功能性多肽運送入培養(yǎng)的

5、真核細胞中，通過研究這些多肽對炎癥中特定信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子基因表達的調(diào)控作用，尋找和篩選新的抗炎多肽，進而為炎癥治療提供新的供選藥物，為炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生機理提供理論和實驗依據(jù)。 但是要實現(xiàn)上述目的，必須解決以下幾個問題：(1)必須有一種工具能有效的攜帶外源的多肽進入細胞內(nèi)，而又不影響細胞的形態(tài)和功能。(2)多肽進入細胞后，能夠通過核膜上的核孔復(fù)合體進入細胞核。(3)有一種簡捷、方便、有效的手段來觀察和研究多肽在細胞內(nèi)的行為。(4)能

6、夠以一種簡便、經(jīng)濟的方式得到研究所需的可供篩選的候選多肽。 為了滿足上述實驗研究的要求，我們利用點突變PCR技術(shù)在本室已有的兩個原核表達載體pET14b-His-EGFP、pET14b-His-MCStop/EGFP的基礎(chǔ)上引入來源于Kaposi肉瘤成纖維細胞生長因子(Kaposifibroblastgrowthfactor，K-FGF)信號肽疏水區(qū)的稱為膜穿透序列膜轉(zhuǎn)位序列(membrane-permeable/translo

7、cationsequence，MPS/MTS)的細胞穿透肽(cellpenetratingpeptide，CPP)序列、SV40大T抗原的核定位信號序列(nuclearlocalizationsequence，NLS)，分別構(gòu)建了細胞穿透肽位于融合蛋白氨基末端和羧基末端的兩個靶向細胞核運輸?shù)牡鞍妆磉_載體。經(jīng)酶切、測序驗證載體構(gòu)建正確后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)表達菌株，表達純化后得到融合蛋白，然后將融合蛋白直接加入培養(yǎng)的真核細胞，

8、利用熒光顯微鏡觀察和Westernblot檢測對融合蛋白的細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)功能及內(nèi)化行為進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞穿透肽位于融合蛋白氨基末端和羧基末端的兩個融合蛋白均可以有效的進入細胞內(nèi)，并且對細胞的毒性非常小。融合蛋白內(nèi)化后細胞內(nèi)定位的動態(tài)觀察表明，熒光標(biāo)記的融合蛋白在加入細胞15min后就可以穿透細胞膜到達細胞內(nèi)，熒光起始主要分布于細胞質(zhì)中，然后隨時間的延長逐漸向細胞核轉(zhuǎn)移，但融合蛋白內(nèi)化后入核布完全，有部分蛋白停留在核周與胞漿。對其運輸動力學(xué)

9、的檢測結(jié)果顯示，它們的內(nèi)化存在濃度依賴效應(yīng)，隨融合蛋白濃度的增加而增加；在時間上也存在一定的依賴關(guān)系，起始隨時間的延長而增加，至3h達高峰，隨后又逐漸下降。 在驗證了靶向細胞核運輸?shù)募毎┩鸽娜诤系鞍拙哂懈咝У霓D(zhuǎn)導(dǎo)功能，并獲得其蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)動力學(xué)方面的一些數(shù)據(jù)后，我們再次使用點突變PCR技術(shù)將編碼12個氨基酸的36個寡核苷酸組成的隨機序列引入構(gòu)建好的蛋白表達載體中，構(gòu)建了可編碼12個氨基酸的隨機多肽表達文庫，并初步估計隨機肽庫的庫容

10、約為1×106。然后從平板上隨機挑取14個單克隆進行了快速菌液PCR鑒定，通過對PCR結(jié)果的分析，判斷隨機多肽插入的情況。進一步從菌液PCR鑒定為陽性的單克隆中抽取若干個，進行DNA測序分析，對隨機肽序列組成的基本框架和多樣性進行了評價。結(jié)果表明，隨機序列插入成功，其組成框架與預(yù)先引物設(shè)計NNK(N=A+G+C+T，K=G+T)模式基本相符，涵蓋了多樣的氨基酸排列形式。 通過以上實驗我們得出如下結(jié)論： 1.本研究中基于細

11、胞穿透肽技術(shù)，利用核定位信號的功能，將兩者的作用相結(jié)合，成功構(gòu)建了可以靶向細胞核進行運輸?shù)牡鞍妆磉_載體。為運輸外源蛋白、多肽及藥物進入細胞提供了一種經(jīng)濟、有效的工具。 2.本研究表明，細胞穿透肽的位置對融合蛋白的原核表達會有一定影響，在氨基末端時，融合蛋白主要以不溶性的包涵體形式存在，而在羧基末端時有高水平的可溶性表達，這提示我們，在實際中應(yīng)用細胞穿透肽進行物質(zhì)運輸時，一定要盡可能詳細的考慮其在融合蛋白中的位置，才能更好的發(fā)揮它

12、們的功能。 3.細胞穿透肽的位置對融合蛋白內(nèi)化后的入核過程沒有明顯影響，引起細胞穿透肽入核不完全的機制有待進一步研究。 4.成功構(gòu)建了可以編碼12個氨基酸的隨機多肽表達文庫，在庫容和多樣性方面均可以滿足篩選的要求，為下一步進行抗炎多肽的篩選奠定了基礎(chǔ)。 綜上所述，本研究從“組學(xué)”的角度出發(fā)，注重真核細胞基因表達調(diào)控的復(fù)雜性、網(wǎng)絡(luò)性等特點，基于炎癥中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子為靶點進行藥物篩選的思路，利用分子、細胞水平藥物高通量