WNT信號通路為靶點(diǎn)的高通量藥物篩選細(xì)胞模型的建立.pdf

1、WNT信號通路的名稱來源于鼠乳腺瘤基因INT-1和果蠅的同源基因WINGLESS,將兩個(gè)基因組合稱為WNT。WNT信號通路在腫瘤發(fā)生中有重要意義，它調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，遷移和分化.由于它在眾多人類腫瘤發(fā)生中廣泛活化，近年來這條通路在腫瘤研究發(fā)面受到很多關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)的目的是建立綠色熒光蛋白(E-GFP)標(biāo)記的以WNT信號通路為靶點(diǎn)的高通量藥物篩選細(xì)胞模型，用于篩選治療與WNT信號通路相關(guān)的腫瘤以及某些疾病的新型藥物。 WNT信號通路有三

2、條主要的分支，其中的WNT-β-CATENIN-LEF/TCF支路，即被稱為經(jīng)典通路的WNT信號傳導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，與腫瘤發(fā)生關(guān)系最為密切[1]。該通路的激活依賴于對細(xì)胞內(nèi)一系列酶和蛋白(例如大腸腺瘤息肉蛋白(APC)、AXIN、酪蛋白激酶(caseinkinase，CK)1a，1e、糖原合成激酶(GSK-3β))所形成的多蛋白復(fù)合物的抑制[2，3]，鋰可以通過抑制糖原合成激酶(GSK-3β)，而抑制該蛋白復(fù)合物偶聯(lián)的泛素化降解機(jī)制

3、，最終降低細(xì)胞內(nèi)β-CATENIN的降解水平，增加β-CATENIN入核，在與多種轉(zhuǎn)錄因子的作用下調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[4]。本實(shí)驗(yàn)用鋰作為該信號通路的激活劑，應(yīng)用于信號通路的細(xì)胞模型建立。 根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)，選擇能夠高效與LEF/TCF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并刺激WNT靶基因表達(dá)的DNA應(yīng)答元件Topflash序列[5]，加入相應(yīng)酶切位點(diǎn)修飾后進(jìn)行人工合成，用分子生物學(xué)的方法，構(gòu)建含有多個(gè)串連WNT靶基因應(yīng)答元件(Topflash)及報(bào)告基

4、因E-GFP的重組載體。用大腸桿菌進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增和大量提取后，將體外培養(yǎng)的細(xì)胞株293E用該重組載體進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，用選擇性藥物進(jìn)行篩選后，用有限稀釋法選取單克隆細(xì)胞，在細(xì)胞由單克隆分裂至一定程度后，將獲得的單克隆細(xì)胞株進(jìn)行單一性、敏感性的篩查，最終挑選出敏感、高效、穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞，凍存及擴(kuò)增后，用于篩選針對WNT信號通路的小分子有機(jī)藥物。 通過一系列實(shí)驗(yàn)，利用本論文中所述的方法，最終建立了高效的藥物篩選細(xì)胞模型，此模型具有篩