鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ活化藥物高通量篩選模型的建立;骨髓基質(zhì)干細(xì)胞治療腦中風(fēng)機(jī)理探討.pdf

1、在神經(jīng)元和其他神經(jīng)細(xì)胞中，鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ具有非常重要的生理作用，其活化是一系列生理學(xué)改變的基礎(chǔ)，因此實(shí)時(shí)有效檢測(cè)鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ活性具有相當(dāng)重要的意義。有實(shí)驗(yàn)表明在GFP融合蛋白的某個(gè)氨基酸殘基磷酸化會(huì)導(dǎo)致GFP熒光改變。作為鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ特異性底物，突觸素Ⅰa能夠被鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ有效磷酸化。為了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ的活化情況，我們通過(guò)轉(zhuǎn)染GFP-突觸素Ⅰa融合蛋白基因至PC12細(xì)胞，建立一株能夠穩(wěn)定表達(dá)GFP-突觸素Ⅰa融合蛋白的細(xì)胞

2、系。1.56mmol/L至50mmol/L濃度的CaCl2在不同程度上增加此細(xì)胞株表達(dá)的GFP-突觸素Ⅰa融合蛋白熒光強(qiáng)度，這種熒光增強(qiáng)現(xiàn)象可能歸因于熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用。使用激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分析也發(fā)現(xiàn)25mmol/LCaCl2能夠明顯增加單個(gè)細(xì)胞中熒光強(qiáng)度。另一方面10μmol/LKN-93(鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ特異性抑制劑)預(yù)處理細(xì)胞，可以明顯抑制甚至降低2mmol/LL-Glu處理細(xì)胞引起的熒光強(qiáng)度增加，但是PKA特異性激活劑2

3、mmol/LDb-cAMP不能使細(xì)胞熒光強(qiáng)度增加，說(shuō)明熒光強(qiáng)度增加主要是由于突觸素Ⅰa位點(diǎn)2和3被鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ磷酸化所致而不是由于位點(diǎn)1被鈣調(diào)蛋白激酶Ⅰ磷酸化引起。Westernblot結(jié)果也證實(shí)，在鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ和突觸素Ⅰa蛋白表達(dá)總量不變情況下，鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ以及突觸素Ⅰa磷酸化水平在細(xì)胞經(jīng)25mmol/LCaCl2處理后明顯升高，同樣，KN-93預(yù)處理能夠抑制甚至降低鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ以及突觸素Ⅰa磷酸化水平。因此可通過(guò)表達(dá)GFP-

4、突觸素Ⅰa融合蛋白的細(xì)胞監(jiān)測(cè)鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ的活化情況，建立起的該細(xì)胞系也可以作為潛在的鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ活化劑的高通量篩選模型。 一、BMSCs參與腦缺血后大腦功能的重建 外部各種因素影響干細(xì)胞選擇性表達(dá)各種組織特異性基因，可以對(duì)細(xì)胞表型產(chǎn)生重塑，達(dá)到定向分化的效果。synapsin作為神經(jīng)元特異表達(dá)的一種蛋白質(zhì)，具有多方面的功能，基因敲除以及反義核苷酸拮抗試驗(yàn)表明synapsin在神經(jīng)元突起的產(chǎn)生以及延長(zhǎng)、軸突分化生長(zhǎng)以及

5、維持、成熟等方面起著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究缺血腦組織抽提液對(duì)培養(yǎng)BMSCs三個(gè)亞型synapsin基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)三個(gè)亞型synapsin基因的表達(dá)經(jīng)缺血腦組織抽提液培養(yǎng)后均有一定程度變化，特別是synapsinⅡa基因的表達(dá)在經(jīng)缺血48小時(shí)腦抽提液培養(yǎng)處理后有顯著升高。進(jìn)一步使用含三個(gè)亞型不同synapsin基因pL(SYNⅠa)SN、pL(SYNⅡa)SN、pLNC(SYNⅢa)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)感染基因進(jìn)入大鼠BMSCs，

6、經(jīng)預(yù)誘導(dǎo)24小時(shí)以及誘導(dǎo)8小時(shí)后，大鼠BMSCs能夠分化形成神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞，免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明部分分化細(xì)胞表達(dá)GFAP或者NF200；與對(duì)照組相比，三種亞型synapsin的表達(dá)均能顯著提高NF200表達(dá)細(xì)胞數(shù)量，這種作用以SynapsinⅡa為最明顯，SynapsinⅠa最弱。而表達(dá)GFAP的細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有明顯改變；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明缺血后大腦環(huán)境的改變能夠促進(jìn)BMSCssynapsin表達(dá)，這種基因表達(dá)增高能夠有效地對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞所分

7、化的細(xì)胞表型進(jìn)行重塑，使其定向分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，并且參與缺血后大腦功能的重建，在BMSCs促進(jìn)缺血后大腦功能恢復(fù)方面起到一定的作用。 二、BMSCs分泌可溶性生長(zhǎng)因子抑制大腦缺血陰影區(qū)細(xì)胞凋亡、維持細(xì)胞存活 TUNEL染色顯示MCAo后在大鼠腦組織缺血陰影區(qū)發(fā)生大量的細(xì)胞凋亡，BMSCs治療能夠顯著地降低凋亡細(xì)胞的數(shù)量。為了探討B(tài)MSCs抑制凋亡的機(jī)理，缺糖缺氧培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞用于模擬體內(nèi)的缺血環(huán)境。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺

8、糖缺氧培養(yǎng)能夠誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡發(fā)生，BMSCs共培養(yǎng)顯著降低凋亡細(xì)胞數(shù)量。Westernblot分析結(jié)果表明，缺糖缺氧處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞中NFκB活化顯著上升，BMSCs共培養(yǎng)能夠通過(guò)抑制IκB的磷酸化而降低NFκB的活化。同時(shí)，缺糖缺氧培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞可以導(dǎo)致凋亡誘導(dǎo)基因Bax表達(dá)升高，而B(niǎo)MSCs共培養(yǎng)則降低這種表達(dá)升高現(xiàn)象。BMSCs共培養(yǎng)還升高星形膠質(zhì)細(xì)胞中c-Myc和Bcl-xl凋亡抑制基因的表達(dá)。由于已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)EGF具

9、有抗凋亡，促增值以及維持細(xì)胞存活的作用，因此我們用缺血后腦組織抽提液培養(yǎng)BMSCs，實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示，缺血48小時(shí)的腦組織抽提液能夠顯著地增加BMSCs中EGFmRNA水平，EGF表達(dá)水平升高可能是BMSCs抑制凋亡發(fā)生的主要因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BMSCs通過(guò)抑制缺血后大腦NFκB活化水平，改變一些凋亡誘導(dǎo)基因或抑制基因的表達(dá)，降低大腦缺血后的細(xì)胞凋亡損傷，從而達(dá)到改善神經(jīng)功能，促進(jìn)損傷修復(fù)的作用。 三、BMSCs通

10、過(guò)增高缺血區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞BMPs表達(dá)而增加內(nèi)源性干細(xì)胞或前體細(xì)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞并參與缺血后大腦的重建 骨形成蛋白(bonemorphogeneticproteins，BMPs)影響細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程。缺血后大腦中的星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)BMSCs反應(yīng)強(qiáng)烈。我們采用一種部分模擬大腦缺血環(huán)境的體外模型，即在缺氧和缺糖的條件下培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，研究BMSCs處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞中BMPs表達(dá)的改變，后者可能對(duì)缺血后大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)方面具有

11、一定的作用。定量實(shí)時(shí)RT-PCR分析表明缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞中BMP2/4表達(dá)降低，BMSCs處理后，缺血星形膠質(zhì)細(xì)胞中BMP2/4表達(dá)水平明顯提高；Westernblotting結(jié)果也證實(shí)了在BMSCs共培養(yǎng)的缺血星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中BMP2/4蛋白水平升高現(xiàn)象。作為一類神經(jīng)干細(xì)胞或前體細(xì)胞的來(lái)源，體外培養(yǎng)大腦室下區(qū)(subventricularzone，SVZ)細(xì)胞在整個(gè)大鼠一生尤其是缺血后能夠參與大腦的神經(jīng)再生。在體外培養(yǎng)SVZ神經(jīng)

12、球，用以探討B(tài)MSCs處理缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的BMP2/4水平變化是否影響大腦神經(jīng)再生過(guò)程。采用缺血星形膠質(zhì)細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)的培養(yǎng)液能夠顯著增加星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的表達(dá)，但是這種增加并不代償性降低β-Ⅲ-tubulin陽(yáng)性SVZ成神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量，另外升高的BMP2/4水平引發(fā)了培養(yǎng)SVZ神經(jīng)球細(xì)胞中BMP下游效應(yīng)物Smad1/5/8磷酸化水平增高以及Hes1(一種Notch信號(hào)通路誘導(dǎo)蛋白)表達(dá)升高，BMP特異性抑制劑