鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ活化藥物高通量篩選模型的建立;骨髓基質(zhì)干細胞治療腦中風機理探討.pdf

1、在神經(jīng)元和其他神經(jīng)細胞中，鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ具有非常重要的生理作用，其活化是一系列生理學改變的基礎，因此實時有效檢測鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ活性具有相當重要的意義。有實驗表明在GFP融合蛋白的某個氨基酸殘基磷酸化會導致GFP熒光改變。作為鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ特異性底物，突觸素Ⅰa能夠被鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ有效磷酸化。為了實時監(jiān)測鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ的活化情況，我們通過轉(zhuǎn)染GFP-突觸素Ⅰa融合蛋白基因至PC12細胞，建立一株能夠穩(wěn)定表達GFP-突觸素Ⅰa融合蛋白的細胞

2、系。1.56mmol/L至50mmol/L濃度的CaCl2在不同程度上增加此細胞株表達的GFP-突觸素Ⅰa融合蛋白熒光強度，這種熒光增強現(xiàn)象可能歸因于熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用。使用激光共聚焦顯微鏡實時監(jiān)測分析也發(fā)現(xiàn)25mmol/LCaCl2能夠明顯增加單個細胞中熒光強度。另一方面10μmol/LKN-93(鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ特異性抑制劑)預處理細胞，可以明顯抑制甚至降低2mmol/LL-Glu處理細胞引起的熒光強度增加，但是PKA特異性激活劑2

3、mmol/LDb-cAMP不能使細胞熒光強度增加，說明熒光強度增加主要是由于突觸素Ⅰa位點2和3被鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ磷酸化所致而不是由于位點1被鈣調(diào)蛋白激酶Ⅰ磷酸化引起。Westernblot結(jié)果也證實，在鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ和突觸素Ⅰa蛋白表達總量不變情況下，鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ以及突觸素Ⅰa磷酸化水平在細胞經(jīng)25mmol/LCaCl2處理后明顯升高，同樣，KN-93預處理能夠抑制甚至降低鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ以及突觸素Ⅰa磷酸化水平。因此可通過表達GFP-

4、突觸素Ⅰa融合蛋白的細胞監(jiān)測鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ的活化情況，建立起的該細胞系也可以作為潛在的鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ活化劑的高通量篩選模型。 一、BMSCs參與腦缺血后大腦功能的重建 外部各種因素影響干細胞選擇性表達各種組織特異性基因，可以對細胞表型產(chǎn)生重塑，達到定向分化的效果。synapsin作為神經(jīng)元特異表達的一種蛋白質(zhì)，具有多方面的功能，基因敲除以及反義核苷酸拮抗試驗表明synapsin在神經(jīng)元突起的產(chǎn)生以及延長、軸突分化生長以及

5、維持、成熟等方面起著重要的作用。本實驗通過研究缺血腦組織抽提液對培養(yǎng)BMSCs三個亞型synapsin基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)三個亞型synapsin基因的表達經(jīng)缺血腦組織抽提液培養(yǎng)后均有一定程度變化，特別是synapsinⅡa基因的表達在經(jīng)缺血48小時腦抽提液培養(yǎng)處理后有顯著升高。進一步使用含三個亞型不同synapsin基因pL(SYNⅠa)SN、pL(SYNⅡa)SN、pLNC(SYNⅢa)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導感染基因進入大鼠BMSCs，

6、經(jīng)預誘導24小時以及誘導8小時后，大鼠BMSCs能夠分化形成神經(jīng)元形態(tài)的細胞，免疫熒光檢測結(jié)果表明部分分化細胞表達GFAP或者NF200；與對照組相比，三種亞型synapsin的表達均能顯著提高NF200表達細胞數(shù)量，這種作用以SynapsinⅡa為最明顯，SynapsinⅠa最弱。而表達GFAP的細胞數(shù)量沒有明顯改變；實驗結(jié)果表明缺血后大腦環(huán)境的改變能夠促進BMSCssynapsin表達，這種基因表達增高能夠有效地對骨髓基質(zhì)干細胞所分

7、化的細胞表型進行重塑，使其定向分化為神經(jīng)元樣細胞，并且參與缺血后大腦功能的重建，在BMSCs促進缺血后大腦功能恢復方面起到一定的作用。 二、BMSCs分泌可溶性生長因子抑制大腦缺血陰影區(qū)細胞凋亡、維持細胞存活 TUNEL染色顯示MCAo后在大鼠腦組織缺血陰影區(qū)發(fā)生大量的細胞凋亡，BMSCs治療能夠顯著地降低凋亡細胞的數(shù)量。為了探討B(tài)MSCs抑制凋亡的機理，缺糖缺氧培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞用于模擬體內(nèi)的缺血環(huán)境。實驗結(jié)果顯示，缺

8、糖缺氧培養(yǎng)能夠誘導星形膠質(zhì)細胞凋亡發(fā)生，BMSCs共培養(yǎng)顯著降低凋亡細胞數(shù)量。Westernblot分析結(jié)果表明，缺糖缺氧處理后星形膠質(zhì)細胞中NFκB活化顯著上升，BMSCs共培養(yǎng)能夠通過抑制IκB的磷酸化而降低NFκB的活化。同時，缺糖缺氧培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞可以導致凋亡誘導基因Bax表達升高，而BMSCs共培養(yǎng)則降低這種表達升高現(xiàn)象。BMSCs共培養(yǎng)還升高星形膠質(zhì)細胞中c-Myc和Bcl-xl凋亡抑制基因的表達。由于已有實驗證實EGF具

9、有抗凋亡，促增值以及維持細胞存活的作用，因此我們用缺血后腦組織抽提液培養(yǎng)BMSCs，實時定量RT-PCR結(jié)果顯示，缺血48小時的腦組織抽提液能夠顯著地增加BMSCs中EGFmRNA水平，EGF表達水平升高可能是BMSCs抑制凋亡發(fā)生的主要因素。本實驗結(jié)果表明BMSCs通過抑制缺血后大腦NFκB活化水平，改變一些凋亡誘導基因或抑制基因的表達，降低大腦缺血后的細胞凋亡損傷，從而達到改善神經(jīng)功能，促進損傷修復的作用。 三、BMSCs通

10、過增高缺血區(qū)星形膠質(zhì)細胞BMPs表達而增加內(nèi)源性干細胞或前體細胞分化為星形膠質(zhì)細胞并參與缺血后大腦的重建 骨形成蛋白(bonemorphogeneticproteins，BMPs)影響細胞的增殖和分化過程。缺血后大腦中的星形膠質(zhì)細胞對BMSCs反應強烈。我們采用一種部分模擬大腦缺血環(huán)境的體外模型，即在缺氧和缺糖的條件下培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞，研究BMSCs處理后星形膠質(zhì)細胞中BMPs表達的改變，后者可能對缺血后大鼠神經(jīng)功能恢復方面具有

11、一定的作用。定量實時RT-PCR分析表明缺血后星形膠質(zhì)細胞中BMP2/4表達降低，BMSCs處理后，缺血星形膠質(zhì)細胞中BMP2/4表達水平明顯提高；Westernblotting結(jié)果也證實了在BMSCs共培養(yǎng)的缺血星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液中BMP2/4蛋白水平升高現(xiàn)象。作為一類神經(jīng)干細胞或前體細胞的來源，體外培養(yǎng)大腦室下區(qū)(subventricularzone，SVZ)細胞在整個大鼠一生尤其是缺血后能夠參與大腦的神經(jīng)再生。在體外培養(yǎng)SVZ神經(jīng)

12、球，用以探討B(tài)MSCs處理缺血后星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的BMP2/4水平變化是否影響大腦神經(jīng)再生過程。采用缺血星形膠質(zhì)細胞與BMSCs共培養(yǎng)的培養(yǎng)液能夠顯著增加星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP的表達，但是這種增加并不代償性降低β-Ⅲ-tubulin陽性SVZ成神經(jīng)細胞的數(shù)量，另外升高的BMP2/4水平引發(fā)了培養(yǎng)SVZ神經(jīng)球細胞中BMP下游效應物Smad1/5/8磷酸化水平增高以及Hes1(一種Notch信號通路誘導蛋白)表達升高，BMP特異性抑制劑