靶向蛋白激酶IKKβ和mTOR的抗腫瘤藥物分子水平篩選模型的建立.pdf

1、長(zhǎng)期以來，炎癥一直被認(rèn)為和癌癥密切相關(guān)，因?yàn)榉磸?fù)發(fā)生的慢性炎癥和感染大大提高了腫瘤的發(fā)病率，但其中的具體分子機(jī)制仍未得到詳細(xì)闡述。近年來隨著研究的深入，逐漸認(rèn)識(shí)到IκB激酶(Inhibitor of kappa B Kinase，IKK)復(fù)合物和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin，mTOR)在慢性炎癥導(dǎo)致癌癥發(fā)生過程中的重要作用。腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factorα

2、，TNFα)等配體的刺激下，IKKβ磷酸化IκBα(inhibitor of NF-κB)分子并誘導(dǎo)其降解，使NF-κB從IκBα-NF-κB復(fù)合體中解離后轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)癌基因與抑癌基因的表達(dá)。而且IKKβ主要通過刺激炎癥因子的分泌在連接炎癥與腫瘤之間的橋梁中發(fā)揮關(guān)鍵作用，IKKβ過表達(dá)或活性增加可以有效刺激炎癥因子的分泌，如TNFα，IL-1，IL-6，IL-8，CSF-1和COX2等。炎癥因子通過調(diào)節(jié)腫

3、瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞之間以及腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，改變了腫瘤細(xì)胞的生存微環(huán)境，內(nèi)源性地促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、擴(kuò)散。作為多條信號(hào)通路的中心節(jié)點(diǎn)，mTOR通路通過廣泛的網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)影響腫瘤的生長(zhǎng)和增殖。生長(zhǎng)因子、有絲分裂原、能量、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)壓力都通過對(duì)抑癌基因TSC1和TSC2的翻譯后修飾調(diào)控mTOR的活性；還有很多激酶，如Akt、Rsk1、Erk、Gsk、Cdk1、p38、Mk2和AMPK，都能作為TSC(Tuberoussc

4、lerosis protein)的激酶，調(diào)節(jié)TSC1/TSC2/mTOR通路，進(jìn)而轉(zhuǎn)導(dǎo)胞外信號(hào)和介導(dǎo)腫瘤生成。尤為重要的是，炎性因子在其中也發(fā)揮著重要作用，如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-Associated Macrophages，TAMs)分泌的TNFα、IL-1β可以通過mTOR介導(dǎo)的VEGF等細(xì)胞因子的表達(dá)促進(jìn)腫瘤生成。另外，活化后的IKKβ還能磷酸化TSC1，改變TSC1的膜定位，阻礙其與TSC2之間的結(jié)合，消除TSC1-TS

5、C2復(fù)合物對(duì)mTOR的抑制作用，進(jìn)而激活mTOR通路并促進(jìn)下游VEGF表達(dá)。因此炎癥因子TNFα能夠激活mTOR通路，并且通過IKKβ介導(dǎo)的對(duì)TSC1的抑制作用促進(jìn)腫瘤血管生成。所以，IKKβ和mTOR通路在炎癥與腫瘤之間搭建了一座橋梁，二者的作用不僅在一定程度上解釋了慢性炎癥和感染引發(fā)腫瘤的原因，更重要的是它們可作為預(yù)防和治療腫瘤潛在的新靶標(biāo)，大大推進(jìn)抗炎抗腫瘤藥物的開發(fā)。因?yàn)榕c傳統(tǒng)單純以腫瘤細(xì)胞為靶點(diǎn)的治療方法相比，同時(shí)針對(duì)腫瘤細(xì)胞

6、和炎癥細(xì)胞的治療方法不僅療效顯著提高，而且不易形成耐藥性，因?yàn)檠装Y細(xì)胞的基因組相對(duì)穩(wěn)定，大大增加了藥物治療的特異性。
　　 本文以此作為出發(fā)點(diǎn)，利用分子生物學(xué)方法分別采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)行IKKβ和mTOR外源蛋白表達(dá)，并對(duì)兩種表達(dá)體系產(chǎn)物的活性進(jìn)行比較。最終采用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，分別構(gòu)建IKKβ全長(zhǎng)和mTOR激酶區(qū)截?cái)嗤蛔凅wmTOR-FKD的Bac-to-Bac供體質(zhì)粒和穿

7、梭質(zhì)粒，通過桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞表達(dá)具有組氨酸標(biāo)簽的IKKβ和mTOR-FKD重組蛋白，經(jīng)過親和層析得到純度較高、活性較好的目的蛋白。以激酶與底物及ATP的體外反應(yīng)為基礎(chǔ)，采用固定變量法，逐一對(duì)激酶反應(yīng)體系中ATP、底物和激酶的濃度進(jìn)行優(yōu)化，并使用陽(yáng)性抑制劑對(duì)篩選模型予以評(píng)價(jià)，確保篩選模型的穩(wěn)定、靈敏。使用基于生物發(fā)光原理的Kinase-GloLuminescent Kinase Assay分析方法，采用均質(zhì)熒光素酶體系進(jìn)行檢測(cè)，擬建立