腫瘤動(dòng)物模型和抗腫瘤藥物的研究方法

1、1,第四章腫瘤動(dòng)物模型和抗腫瘤藥物的研究方法,2,˙惡性腫瘤——常見病、多發(fā)病˙全世界每年700萬死亡；占?xì)W美死亡第二位˙我國(guó)城市居民第一位，農(nóng)村第三位˙惡性腫瘤人類健康重要——?dú)⑹?進(jìn)展較大, 疑難問題很多。腫瘤動(dòng)物模型和抗腫瘤研究方法具有重要意義。,3,4,腫瘤動(dòng)物模型可分為三類：,自發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型移植性腫瘤動(dòng)物模型,5,第一節(jié) 自發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型,(animal model of sponta

2、neous tumors),概念: 未經(jīng)人為處理；自然發(fā)生,? 自發(fā)性乳腺癌模型? 自發(fā)性白血病模型,6,一、自發(fā)性乳腺癌模型,生長(zhǎng)在體表,易早期發(fā)現(xiàn),罕有自發(fā)消退,因而能準(zhǔn)確觀察其大小與生長(zhǎng)速度,便于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。,,7,現(xiàn)介紹三種自發(fā)性乳腺癌小鼠模型,C3H小鼠：繁殖用雌鼠自發(fā)性乳腺癌發(fā)生率為 85%~100%。,,A系小鼠： 經(jīng)產(chǎn)雌鼠乳腺腫瘤發(fā)生率為30%~80%。,CBA小鼠：雌鼠自發(fā)性乳腺癌發(fā)生率為60%

3、~65%。,8,在乳腺左右兩側(cè)及乳頭部均可發(fā)生腫瘤。每只小鼠常見1個(gè)以上腫瘤。選擇腫瘤數(shù)目和大小相近的動(dòng)物, 配對(duì)分組,給予受試藥,觀察受試藥對(duì)腫瘤發(fā)展的影響。,給藥方案和給藥途徑可根據(jù)受試藥物的特點(diǎn)確定。因自發(fā)性乳腺癌發(fā)展較緩慢，故采用間歇給藥或小劑量連續(xù)給藥較為合適。,9,[結(jié)果判定],給藥后每天觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，記錄發(fā)生時(shí)間和位置。,腫瘤結(jié)節(jié)長(zhǎng)到一定程度,每周用腳規(guī)測(cè)量皮下腫瘤2次。測(cè)定腫塊的最大徑(a)和最小徑(b)。

4、腫瘤體積(cm3) = ab2/2,10,將腫瘤體積變化對(duì)時(shí)間作出生長(zhǎng)曲線,可由曲線的斜率變化判斷藥物抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用,尤其應(yīng)觀察腫瘤能否完全消退。,11,[注意事項(xiàng)]1.在同一品系內(nèi),發(fā)病率比較穩(wěn)定,而不同品系間差別甚大。 2.動(dòng)物乳腺癌發(fā)生與遺傳基因、乳癌因子(即致乳癌病毒)及激素有關(guān)。,3.飼料的變更有明顯影響,要用固定全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料。 4.配對(duì)分組。,12,二、AKR白血病模型 AKR小鼠為白血病高發(fā)品系，淋巴細(xì)胞白

5、血病發(fā)病率雄性76%~90%，雌性為68%~90%。,[操作步驟] 實(shí)驗(yàn)用6~12月齡AKR小鼠, 此時(shí)鼠的脾和淋巴結(jié)腫大, 血象異常。 經(jīng)血液檢查確診為白血病后的次日, 配對(duì)分組并開始給予受試藥, 觀察結(jié)果。,,13,觀察指標(biāo)：末梢血象,白細(xì)胞數(shù),淋巴結(jié)和脾大小,動(dòng)物生存時(shí)間。有效者生存期比對(duì)照組延長(zhǎng), 并根據(jù)血象評(píng)價(jià)藥物的誘導(dǎo)緩解和維持緩解作用。,各鼠白血病的病程不一,自發(fā)瘤確診后, 實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)配對(duì)分組。,[結(jié)果判定],

6、[注意事項(xiàng)],14,[自發(fā)性腫瘤的總體評(píng)價(jià)],動(dòng)物自發(fā)性腫瘤的病因往往是由動(dòng)物的遺傳特性決定的,與人癌的病因有較大距離。,各動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)速度差異較大, 很難在限定時(shí)間內(nèi)獲得大量生長(zhǎng)均勻的荷瘤動(dòng)物(tumor-bearing animals),因此，自發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型很少在抗腫瘤藥物的常規(guī)篩選中廣泛應(yīng)用。,15,第二節(jié) 誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型,(animal models of induced tumor),概念: 在實(shí)驗(yàn)條件下;

7、 使用致癌物(carcinogens); 誘發(fā)動(dòng)物發(fā)生腫瘤,16,[基本原理],利用外源性致癌物引起細(xì)胞遺傳特性改變，從而出現(xiàn)異常生長(zhǎng)和高增殖活性細(xì)胞,形成腫瘤。 外源性致癌物主要有化學(xué)性、物理性(如放射性物質(zhì))及生物性(如誘發(fā)動(dòng)物腫瘤的病毒),其中以化學(xué)性致癌物最為常用。,17,一、誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型的基本方法,實(shí)驗(yàn)時(shí),必需注意選擇合適的致癌方法、動(dòng)物種系、致癌物及其溶劑、給予劑量、途徑以及

8、觀察時(shí)間等。致癌物的劑量應(yīng)能保證動(dòng)物的存活率較高、誘發(fā)期較短和誘發(fā)腫瘤頻率較高。,18,常用的致癌物給予方法和途徑,1.涂抹法: 涂抹在背部及耳部皮膚,主要用于誘發(fā)皮膚腫瘤。,2.經(jīng)口給藥法：通過飲水、飼料或灌喂動(dòng)物。常用于食道癌、胃癌及大腸癌等。,3.注射法：致癌物制成溶液,經(jīng)皮下、肌內(nèi)、靜脈或體腔等途徑注入體內(nèi),本法較常用。,19,常用的致癌物給予方法和途徑,4.氣管注入法：常用于誘發(fā)肺癌。,5.穿線法：將致癌物置于無菌試管內(nèi),加熱

9、使之液化,吸附于預(yù)制的線結(jié)上,再將此線結(jié)穿入靶組織而誘發(fā)腫瘤。,6.埋藏法：包埋于皮下或其他組織內(nèi)。,20,二、誘發(fā)性腫瘤模型的動(dòng)物和致癌物,動(dòng)物：大鼠，小鼠，犬等致癌物：多環(huán)碳?xì)漕悂喯醢奉惻嫉慄S曲霉毒素 （飼料中含0.001~0.015ppm黃曲霉毒素B1, 喂養(yǎng)6個(gè)月,誘發(fā)大鼠肝癌）。 ppm = parts per million,21,22,[誘發(fā)性腫瘤模型的總體評(píng)價(jià)],約80%人癌是由環(huán)境因素引起的, 誘發(fā)性

10、腫瘤的病因與人癌的情況近似, 且均經(jīng)過較長(zhǎng)演變過程而成瘤。動(dòng)物誘發(fā)性腫瘤是比較類似于人類腫瘤的動(dòng)物模型。,然而,人癌的發(fā)生原因十分復(fù)雜,往往并非由已知的動(dòng)物致癌物所引起。另外,動(dòng)物誘發(fā)性腫瘤的組織病理類型、發(fā)生發(fā)展過程也不一定與人癌完全一致。,23,本模型的最大困難是誘癌時(shí)間長(zhǎng)、成癌率常達(dá)不到100%, 而且動(dòng)物之間腫瘤發(fā)生時(shí)間、發(fā)展速度的個(gè)體差異很大, 難以將未治療的動(dòng)物作為治療動(dòng)物的對(duì)照。,24,第三節(jié)移植性腫瘤動(dòng)物模型(An

11、imal model of transplanting tumors),25,移植性腫瘤動(dòng)物模型是指將動(dòng)物或人體腫瘤移植到同種或異種動(dòng)物體內(nèi)連續(xù)傳代而形成的腫瘤。,該實(shí)驗(yàn)法是抗腫瘤藥物篩選最常用的體內(nèi)方法，具有重要作用。目前臨床上常用的抗腫瘤藥大多是首先經(jīng)該實(shí)驗(yàn)法而被發(fā)現(xiàn)的。,26,一般給予試驗(yàn)藥7~10d, 在第8~11d可解剖動(dòng)物獲得結(jié)果。通過一些指標(biāo)的觀察, 可以判斷試驗(yàn)藥是否有具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。這是任何體外試驗(yàn)所不能替代的

12、, 其結(jié)果可為抗癌藥物療效提供重要依據(jù)。,27,它比前述的自發(fā)性和誘發(fā)性動(dòng)物腫瘤更易實(shí)施。 現(xiàn)有移植性腫瘤接種成功率可達(dá)100%, 可在同一時(shí)間內(nèi)獲得大量(數(shù)十至百余只動(dòng)物)、生長(zhǎng)相當(dāng)均勻的腫瘤。,28,移植性腫瘤常用的動(dòng)物為小鼠、大鼠和地鼠。研究藥物的抗腫瘤作用可選擇三種或三種以上小鼠、大鼠的移植性腫瘤進(jìn)行實(shí)驗(yàn)治療；抗腫瘤藥物篩選時(shí)，每批動(dòng)物的來源應(yīng)一致；,一、動(dòng)物的選擇,29,根據(jù)瘤株的特點(diǎn)選用近交系、遠(yuǎn)交系或F1動(dòng)物；雌雄性動(dòng)物均

13、可應(yīng)用(乳腺癌等必須用雌性動(dòng)物)。 ▲每批實(shí)驗(yàn)只用同一性別動(dòng)物。 ▲小鼠體重18~22g，大鼠體重50~70g ▲每組至少10只動(dòng)物，裸鼠可用5~10只。,30,二、腫瘤細(xì)胞的選擇,復(fù)制移植性腫瘤模型需要使用腫瘤細(xì)胞株(瘤株，tumor strain)或細(xì)胞系(cell line)。 細(xì)胞株(cell strain)是指通過選擇法或克隆法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊遺傳、生化性質(zhì)或特異標(biāo)記的細(xì)胞群。,31,瘤株

14、的組織學(xué)類型和生長(zhǎng)特征趨于穩(wěn)定，并能在同系、同種或異種動(dòng)物體內(nèi)移植并連續(xù)傳代。 生長(zhǎng)特征，包括接種成活率、生長(zhǎng)速度、自動(dòng)消退率、宿主壽命與宿主反應(yīng)等。,細(xì)胞系：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細(xì)胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系所組成。,32,目前，動(dòng)物移植性實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤（包括實(shí)體瘤、腹水瘤和白血?。┘s500種，還有大量人的瘤株或細(xì)胞系。常用的動(dòng)物移植性腫瘤瘤株或細(xì)胞系有：,33,肉瘤S180腹水型或?qū)嶓w型艾氏腹水癌或?qū)嶓w型

15、肝癌腹水型（HepA）或?qū)嶓w型（H22） 小鼠白血病L1210、P388及L615小鼠黑色素瘤（B16） 小鼠Lewis肺癌 肉瘤S37結(jié)腸癌C38、結(jié)腸癌C26 子宮頸癌（U14）大鼠Walker癌肉瘤256（W256）,34,篩選抗癌藥物時(shí)，最好選用3類瘤株，即肉瘤、腹水型腫瘤和白血病株。在眾多移植性腫瘤中，目前最受重視和應(yīng)用最廣的是： 小鼠Lewis肺癌 小鼠黑色素瘤B16 小鼠白血病P388,瘤

16、株或細(xì)胞系的選擇應(yīng)盡量考慮與臨床擬研究腫瘤的性質(zhì)、部位等相近，如擬研究肝癌的治療，可首選肝癌瘤株。,35,一種藥物不一定對(duì)各種類型移植性腫瘤都有效，如果僅選一種瘤株進(jìn)行藥物篩選就可能出現(xiàn)漏篩。 還必須指出，動(dòng)物腫瘤的生物學(xué)特點(diǎn)與人類腫瘤有較大差別，對(duì)動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)有抑制作用的藥物對(duì)人類腫瘤未必有效。,36,三、接種方法,(一)一般要求 整個(gè)操作應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，可在無菌室和超凈工作臺(tái)內(nèi)操作。動(dòng)物處死后消毒皮膚，對(duì)每個(gè)實(shí)體

17、瘤應(yīng)分別使用滅菌的外科器械切取，對(duì)腹水瘤則應(yīng)分別用滅菌的注射器抽吸。,37,接種方法,瘤塊污染常是接種失敗的主要原因，應(yīng)特別注意!!在高溫季節(jié)操作時(shí)，可在盛有瘤源的器皿周圍放置冰塊直接降溫。 常用接種部位： 實(shí)體瘤_____腋窩皮下 肌肉接種___大腿肌肉 腹水型腫瘤__腹腔,38,(二)接種操作1.實(shí)體瘤,(1)基本過程（以實(shí)體瘤為例）,凍存的瘤株,--->,移入宿主體內(nèi),（瘤源動(dòng)物）,-------&

18、gt;,7-10 d,(增殖),獲得瘤塊,--->,制備瘤塊,--->,給動(dòng)物接種,(受體動(dòng)物),39,(2)瘤塊接種法：選取接種后7~10d生長(zhǎng)狀態(tài)良好的瘤源動(dòng)物，頸椎脫臼處死，消毒操作部位皮膚。切開皮膚，剝離出瘤塊，置于平皿上,平皿應(yīng)放置在冰塊上,內(nèi)置少許滅菌的PBS或其他營(yíng)養(yǎng)液,剔除非腫瘤組織和壞死組織，選取生長(zhǎng)良好而無變性壞死、淡紅色、魚肉狀的瘤組織，在無菌平皿內(nèi)剪成2mm3的小塊。 黑色素瘤則呈黑色或黑紫

19、色 注意不用瘤中央的壞死部分,40,瘤源動(dòng)物,--->,頸椎脫臼處死,--->,--->,消毒切開皮膚,--->,取瘤剪成 2mm3 小塊,--->,用套管針抽吸瘤塊,接種于受體動(dòng)物右前肢腋窩皮下,縮短接種操作時(shí)間,從瘤塊取材到接種完畢一般應(yīng)在30min內(nèi)；平皿內(nèi)放置少許滅菌PBS或其他營(yíng)養(yǎng)液；接種部位皮膚應(yīng)先消毒。,流程圖：,41,(3)瘤細(xì)胞懸液接種法 如每次需要接種的動(dòng)物數(shù)量較多

20、時(shí)，可用瘤細(xì)胞懸液接種:,取幾個(gè)瘤塊,--->,除去壞死部分,--->,混合瘤塊,--->,剪成小塊,--->,勻漿器單向研勻,--->,放入無菌容器,--->,生理鹽水稀釋成1:3~1:4懸液,每只動(dòng)物接種0.2ml；整個(gè)操作應(yīng)在30min內(nèi)完成；每次抽吸前應(yīng)將細(xì)胞混勻。,42,(4)培養(yǎng)細(xì)胞接種法： 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞→胰酶消化→PBS洗滌2次→計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)→用生理鹽水稀釋成細(xì)胞懸液→細(xì)胞懸液置于

21、冰上→注射到接種部位(0.2ml,含1×106~1×107個(gè)細(xì)胞)。,43,2. 腹水型腫瘤 (1)抽取腹水：,選擇接種后7~10 d 的健康動(dòng)物,頸椎脫臼處死,--->,腹部皮膚消毒,--->,剪開剝?nèi)ジ共科つw,--->,抽吸腹水,--->,放入無菌容器內(nèi),--->,若用幾只動(dòng)物作為瘤源動(dòng)物時(shí),應(yīng)將腹水混合.,44,45,另取小量腹水,置于加有肝素的干試管內(nèi),作為觀察

22、細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞計(jì)數(shù)用。 將空針中剩余的腹水制備推片,瑞氏染色,鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù),其中瘤細(xì)胞數(shù)應(yīng)≥95%。,抽出的腹水應(yīng)為乳白色濃稠液體,若為黃色或含有大量紅細(xì)胞時(shí)應(yīng)棄去。,46,(2)細(xì)胞計(jì)數(shù)： 取肝素管內(nèi)的瘤細(xì)胞,用生理鹽水稀釋10倍;取稀釋液0.9ml,加0.2%臺(tái)盼藍(lán)生理鹽水溶液0.1ml混勻。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)瘤細(xì)胞總數(shù)和死細(xì)胞數(shù)。 瘤細(xì)胞死亡后，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，細(xì)胞可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色, 而活細(xì)胞不

23、著色。,47,48,計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)板四角大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù), 計(jì)數(shù)時(shí)對(duì)壓邊線的細(xì)胞,計(jì)左不計(jì)右,計(jì)上不計(jì)下。計(jì)數(shù)四個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù),然后按下列公式計(jì)算總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞總數(shù)。,四大方格細(xì)胞總數(shù)－死細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞數(shù)/ml懸液＝ ×稀釋倍數(shù)×10000

24、 4,,49,(3) 接種： 腹水用含葡萄糖的無菌Hanks液稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛? 每只鼠腹腔注入0.1~0.2ml。整個(gè)操作應(yīng)在60min內(nèi)完成。,50,3. 白血病株的接種 腹水型白血病如L1210及P388的接種方法同腹水型腫瘤接種法。,51,四、腫瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇 為了使腫瘤細(xì)胞能得以長(zhǎng)期使用，防止退化或變異，保存不同代細(xì)胞的特征，對(duì)腫瘤細(xì)胞或瘤株進(jìn)行冷凍保存是很必要的。一般在液氮中凍存1~2年，細(xì)

25、胞存活率可達(dá)80%~90%。,52,1.凍存方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期增殖細(xì)胞，在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液。經(jīng)胰蛋白酶消化、離心、洗滌，用含7份培養(yǎng)液、2份小牛血清、1份DMSO配成(1~5)×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入細(xì)胞凍存管，貼上標(biāo)簽，注明細(xì)胞來源、名稱及凍存日期。,53,一般將凍存管: ①4℃--30min；－20℃--4h；－70℃--過夜--然后入液氮。 ②可將凍存管懸掛液氮罐口處過夜，之后浸入液氮

26、中。 ③可用2cm厚脫脂棉將凍存管嚴(yán)密包裹,－20℃~－30℃過夜，然后除去脫脂棉直接放入液氮中。,54,2.凍存細(xì)胞的復(fù)蘇方法 從液氮罐中取出凍存管，迅速放入38℃ ~ 40℃水浴中，并不停搖動(dòng)使其在1min內(nèi)全部融化，500~800r/min離心5min，棄上清，加入培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)液，以后按常規(guī)培養(yǎng)。,55,細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的原則是“慢凍快融”，標(biāo)準(zhǔn)的冷凍速度是每分鐘－1℃~－2℃，到－70℃以下時(shí)

27、可迅速放入液氮中。 所凍存的細(xì)胞必須是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞密度應(yīng)在106個(gè)/ml以上。,56,第四節(jié)人體腫瘤異種移植性腫瘤模型,57,異種移植性腫瘤是移植性腫瘤的一種，近年很重視人體腫瘤的動(dòng)物體內(nèi)移植模型。因?yàn)檫@種模型使用人的腫瘤細(xì)胞，在組織形態(tài)和遺傳特征等方面，均與人類腫瘤相同，故用這種模型可以比較直接研究人類腫瘤的生物學(xué)特性及抗腫瘤藥物。,58,由于異種移植的移植排斥反應(yīng)?？蓪?dǎo)致移植失敗，故選擇適合的受體動(dòng)物是移植成功的

28、關(guān)鍵。常用的宿主動(dòng)物主要有裸小鼠和C57BL/6小鼠，也可用免疫抑制劑或放射線等降低動(dòng)物的免疫功能后，再進(jìn)行移植。,59,一、裸小鼠作為移植宿主 裸小鼠是在SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)繁殖生長(zhǎng)的BALB/c裸小鼠，6~8周齡，體重21~22g。 [瘤源] 人體腫瘤細(xì)胞的來源大致可分為兩類，一類是人的腫瘤細(xì)胞株(系)；另一類是源于人體腫瘤組織塊的癌細(xì)胞。,常用人癌裸鼠移植的細(xì)胞株(系)、接種方式和最佳生長(zhǎng)期見教材。,60,二、免

29、疫功能抑制的大鼠作為移植宿主 由于裸鼠嬌弱，飼養(yǎng)條件要求高，費(fèi)用昂貴，故用裸鼠復(fù)制人體腫瘤異種移植腫瘤模型較難普遍應(yīng)用。 使用免疫功能受抑制的大鼠接種人癌細(xì)胞，可獲得人癌動(dòng)物模型。 先皮下注射阿糖胞苷，2d后用10Gy 60Co全身照射。,61,第五節(jié)抗腫瘤藥物體內(nèi)研究方法,62,基本步驟是: 低溫保存瘤細(xì)胞—速融—加冷培養(yǎng)液洗除凍存液—用培養(yǎng)液將腫瘤細(xì)胞調(diào)至一定濃度—給特定動(dòng)物 (宿主)注射 (ip或sc)。

30、 腫瘤細(xì)胞在宿主動(dòng)物體內(nèi)增殖后—取出—給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(受體動(dòng)物)進(jìn)行接種(荷瘤動(dòng)物)。,不同腫瘤的宿主動(dòng)物、取用腫瘤的時(shí)間及接種方法見表4-1。,63,一、實(shí)體瘤(√)  [分組給藥] 接種次日將動(dòng)物隨機(jī)分組：☉實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(C)：接種腫瘤細(xì)胞不給受試藥，只給受試藥相應(yīng)的溶劑☉受試藥組(T)：設(shè)高、中、低3個(gè)劑量（給藥1次或數(shù)次，給藥途徑應(yīng)與推薦臨床用藥的途徑相同，靜脈給藥者可用腹腔注射代替）。 ☉

31、陽性對(duì)照藥：對(duì)瘤株活性高的已知抗腫瘤藥,64,＊對(duì)S180 , 艾氏腹水癌實(shí)體型 可用環(huán)磷酰胺20~ 30 mg /(kg .d) ＊對(duì)L615 可用5-氟尿嘧啶25mg /(kg.d) ＊對(duì)其他腹水型腫瘤一般用絲裂霉素 2mg / (kg.d) ＊對(duì)W256 可用絲裂霉素4mg/ (kg.d)+環(huán)磷酰胺20~ 30mg/(kg.d ),65,[療效評(píng)價(jià)] 停藥24h后處死動(dòng)物,稱體重,剝離瘤

32、塊, 稱瘤重。受試藥物對(duì)實(shí)體瘤的療效以瘤重抑制率表示： C－T 瘤重抑制率 (%)= ×100% C 式中T:受試藥物組平均瘤重; C:實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 (模型組,荷瘤未用藥動(dòng)物) 平均瘤重。 (瘤重抑制率%=[(1－T/C)]

33、5;100%計(jì)算）,,66,觀察瘤重抑制率時(shí)，要求實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠瘤重均值不得低于1g（大鼠瘤重均值不得低于2g），否則表示腫瘤生長(zhǎng)不良，實(shí)驗(yàn)作廢。,給藥組動(dòng)物平均體重下降（給藥前后自身比較）不得超過15%，動(dòng)物死亡數(shù)不得超過20%，否則表示受試藥有毒性反應(yīng)，應(yīng)減少劑量重新實(shí)驗(yàn)。,67,若中草藥瘤重抑制率大于30%，合成藥大于40%，且與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，重復(fù)3次，療效均穩(wěn)定，則評(píng)定該受試藥具有一定抗腫瘤作用。,68,[注意事

34、項(xiàng)] 實(shí)驗(yàn)中如果幾個(gè)藥給藥組共用一個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組時(shí)，后者的動(dòng)物數(shù)應(yīng)適當(dāng)增加,公式為: C＝G×M。 式中C=實(shí)驗(yàn)對(duì)照組動(dòng)物數(shù)；G=同時(shí)試驗(yàn)的化合物數(shù)或同時(shí)試驗(yàn)的藥物數(shù)；M=給藥組的動(dòng)物數(shù)。 如試驗(yàn)的藥物數(shù)G為2，各給藥組M均為10，故C＝2×10，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的動(dòng)物數(shù)為20。,69,二、腹水型腫瘤(√)  [分組給藥] 于接種后次日將動(dòng)物隨機(jī)分組并開始給藥，受試藥設(shè)高、中、低

35、3個(gè)劑量組，口服或腹腔注射給藥，連續(xù)給藥5~10次。,70,[療效評(píng)價(jià)] 接種后觀察和記錄動(dòng)物死亡時(shí)間和生存天數(shù)。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組動(dòng)物通常在2~3周內(nèi)全部死亡。如實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中≥20%動(dòng)物存活超過4周，表明腫瘤生長(zhǎng)不良，實(shí)驗(yàn)作廢。 如給藥治療期間實(shí)驗(yàn)對(duì)照組動(dòng)物于7d內(nèi)死亡率≥20%，表示腫瘤生長(zhǎng)過快，實(shí)驗(yàn)失敗。,71,腹水瘤以荷瘤動(dòng)物的生命延長(zhǎng)時(shí)間作為療效指標(biāo)，計(jì)算每組動(dòng)物的平均存活時(shí)間，給藥組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的平均生存天數(shù)之比[(T/

36、C)%]大于125%為有效。,在接種后60d分別記錄給藥組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組動(dòng)物的平均生存時(shí)間(如果生存超過60d，按60d計(jì)算)，按下列公式計(jì)算生命延長(zhǎng)率：,72,式中:T為受試藥物組平均生存天數(shù)； C為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組平均生存天數(shù)。,T －C 生命延長(zhǎng)率( %)＝ ×100% C,,73

37、,若腹腔注射給藥時(shí)生命延長(zhǎng)率＞75%，非腹腔注射給藥生命延長(zhǎng)率＞50%，且與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，重復(fù)3次，療效穩(wěn)定，則評(píng)定該受試藥具有一定抗腫瘤作用。,74,[注意事項(xiàng)] 1.關(guān)于幾個(gè)給藥組共用一個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組時(shí),實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的動(dòng)物數(shù)，同實(shí)體瘤。 2.實(shí)驗(yàn)開始及結(jié)束時(shí)應(yīng)分別稱動(dòng)物體重，若給藥組動(dòng)物體重明顯低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組時(shí)(如超過15%)，判定療效時(shí)應(yīng)注意體重降低對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響，排除非特異的毒性作用。 3.腹水型

38、腫瘤的研究方法,也適用于腹水型白血病，如L1210及P388。,75,三、移植性腫瘤研究方法的應(yīng)用 (一)肉瘤S180模型（實(shí)體瘤）(√) 小鼠肉瘤S180(sarcoma180)是經(jīng)典的動(dòng)物腫瘤模型之一，在抗腫瘤藥物體內(nèi)篩選中被廣泛應(yīng)用。S180有實(shí)體型和腹水型兩種生長(zhǎng)形式，可以以一種形式傳代，實(shí)體型與腹水型可互轉(zhuǎn)。,76,[操作步驟] 1. 取接種在昆明小鼠約7~10d的S180腫瘤→剔除腫瘤包膜和壞

39、死部分→置于玻璃勻漿器內(nèi)→加入生理鹽水配制成含瘤細(xì)胞為(1~2)×107/ml單細(xì)胞懸液→ 接種于同種異體小鼠腋窩皮下, 每只小鼠注射0.2ml(含瘤細(xì)胞2×106 ~4×106個(gè))。,77,2.接種后第1d 稱體重、隨機(jī)分組并開始給藥, 包括: ▲實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 ▲陽性對(duì)照藥組 （環(huán)磷酰胺,接種次日1次性ip,100mg/kg） ▲受試藥高劑量組 ▲

40、受試藥中劑量組 ▲受試藥低劑量組,78,腹腔注射或灌胃給藥. 給藥方案有多種。 至接種后第11~14d, 稱量動(dòng)物體重, 解剖腫瘤并稱重。,79,[結(jié)果計(jì)算] S180實(shí)體瘤生長(zhǎng)速度與接種量成正比，一般重2.5g的腫瘤需生長(zhǎng)8~11d。根據(jù)各組動(dòng)物瘤重按前述公式計(jì)算瘤重抑制率，并進(jìn)行藥物療效評(píng)定。,80,[注意事項(xiàng)] 1. 本方法也適用于B16、Hep、W256和C26等實(shí)體型移植性腫瘤模型。 2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)

41、束時(shí), 陽性對(duì)照組腫瘤基本不長(zhǎng)或長(zhǎng)得很小, 即陽性對(duì)照組的抑瘤率應(yīng)大于80%以上, 而實(shí)驗(yàn)對(duì)照組動(dòng)物在此期間瘤重應(yīng)在2g左右。,,81,3.受試藥組動(dòng)物體重不低于原始體重的20%,否則表示受試藥劑量過高, 需降低劑量重試。 4.腋窩部皮膚松弛，皮下接種后能允許腫瘤生長(zhǎng)得較大，也可接種于腹股溝部皮下。,82,黑色素瘤,83,84,,模型組,陽性藥組,給藥組,85,(二)大鼠W256癌肉瘤模型(×)瓦克癌肉瘤256（Wal

42、ker256，簡(jiǎn)稱W256）的生長(zhǎng)有實(shí)體型和腹水型兩種形式，并可互轉(zhuǎn)。接種在皮下或肌肉內(nèi)成為實(shí)體瘤, 接種在腹腔則成為腹水瘤。在接種后開始給藥治療, 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后比較對(duì)照組與試驗(yàn)組的瘤重或大鼠平均存活時(shí)間, 可判斷受試藥物的療效。,86,[操作步驟] 1.取接種于大鼠大腿肌肉或腹腔第7d、接種于皮下11~13d的W256瘤, 配制成瘤細(xì)胞懸液 (約2×106 ~4×106個(gè)瘤細(xì)胞)。取體重55~65g Wistar大

43、鼠, 雌雄不限, 每次實(shí)驗(yàn)均用同一性別。每鼠大腿肌內(nèi)接種瘤細(xì)胞懸液0.2ml, 每組用6~10只動(dòng)物。,,87,2.接種后第1d稱動(dòng)物體重, 隨機(jī)分組并開始給藥,均用腹腔注射,每天1次, 連續(xù)7~10d,至第8~11d處死動(dòng)物, 將雙側(cè)后肢從髖關(guān)節(jié)外剪下,分別稱重,荷瘤肢體重減去對(duì)側(cè)正常肢體重即為瘤重。,88,[結(jié)果計(jì)算] 按前述公式計(jì)算瘤重抑制率。 [注意事項(xiàng)] 1.本方法也適用于S180及艾氏腹水瘤等腫瘤。

44、2.接種的瘤源有兩種；用腹水型瘤源, 傳代6~8d 的瘤源(抽出的腹水為血性);用皮下接種的瘤, 用勻漿法制成瘤細(xì)胞懸液。,89,3.對(duì)照組肌肉型平均瘤重在3~5g; 皮下腫瘤平均瘤重為3~12g; 腹水型動(dòng)物平均生存10~14d。 4.第7d 給藥組動(dòng)物存活率應(yīng)大于65%, 否則表明所試藥物劑量過大。,90,(三)Lewis肺癌模型(√) 1951年Lewis在未經(jīng)過處理的C57BL小鼠肺發(fā)現(xiàn)了未分化上皮樣腫瘤，此后

45、建立了實(shí)體型移植性腫瘤模型。,91,[操作步驟] 1.取C57BL/6小鼠皮下接種8~12d的Lewis肺癌作為瘤源，無菌條件下剝離瘤組織，用剪刀剪成小塊，用套管針移植或用玻璃勻漿器加無菌生理鹽水(1:3)研磨成勻漿，過400目絲網(wǎng)，成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)每毫升勻漿液中的瘤細(xì)胞數(shù)。,2.給每只成年C57BL/6小鼠腋窩皮下接種2×106個(gè)細(xì)胞（0.2ml/只）。,92,3.接種后第1天進(jìn)行動(dòng)物分組并給藥，陽性對(duì)照藥用環(huán)磷

46、酰胺50mg/kg體重(0.2ml/10g體重),隔日灌胃給藥，共給3次。給藥組每天灌胃給予受試藥1次，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組給予等體積生理鹽水，連續(xù)10d。,4.末次給藥后24h處死動(dòng)物，稱體重，剝離腋窩下腫瘤并稱重，計(jì)算瘤重生長(zhǎng)抑制率。,93,皮下移植Lewis肺癌的C57BL/6小鼠,94,Lewis肺癌移植瘤,95,[模型評(píng)價(jià)] Lewis肺癌惡性程度較高，受體鼠為C57BL/6小鼠，是目前國(guó)際應(yīng)用較普遍的移植腫瘤模型之一，由于其接種部

47、位的不同，用途比較廣泛。本方法是評(píng)價(jià)藥物體內(nèi)抗腫瘤作用最常用的方法，對(duì)藥物作用的預(yù)測(cè)性很好。,96,[注意事項(xiàng)] 1.實(shí)驗(yàn)開始和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)應(yīng)分別稱量動(dòng)物體重，如果給藥組動(dòng)物體重明顯低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（超過15%），判定藥物療效時(shí)應(yīng)注意體重降低對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響，排除非特異的毒性作用。,2.腫瘤接種后2周，單個(gè)鼠瘤重應(yīng)在500 mg以上，否則說明腫瘤生長(zhǎng)不良，腫瘤接種失敗。,97,3.對(duì)某些效價(jià)較低的藥物，如未純化中草藥有效成分或多糖類的

48、篩選，可將瘤細(xì)胞接種于后肢爪墊皮下，接種細(xì)胞數(shù)為(2~4)×105/0.02ml（細(xì)胞數(shù)僅為常規(guī)皮下接種量的1/3），接種后給藥治療，10d后從踝關(guān)節(jié)處切除帶瘤的足稱重，計(jì)算瘤重抑制率。若切除帶瘤的足后繼續(xù)給藥，還可觀察受試藥對(duì)肺轉(zhuǎn)移的療效。,98,(四)L1210白血病小鼠模型(×) L1210白血病最早是用甲基膽蒽在DBA/2小鼠誘發(fā)的，能在DBA/2小鼠及其雜交一代BDF1和CDF1小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)。小鼠白

49、血病L1210為腹水型腫瘤，是最常用的移植性腫瘤模型。,將1×105個(gè)腹水瘤細(xì)胞接種在DBA/2、BDF1或CDF1小鼠腹腔內(nèi)，接種后24 h開始給藥治療，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后比較給藥組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠的平均存活時(shí)間，可判斷藥物的療效。,99,[操作方法] 1.取接種于DBA/2小鼠約7d的L1210腹水，用生理鹽水配成瘤細(xì)胞數(shù)為106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于BDF1或CDF1小鼠腹腔內(nèi)，每只小鼠接種0.1ml（含瘤細(xì)胞1

50、5;105個(gè)）。,100,2.實(shí)驗(yàn)當(dāng)天接種動(dòng)物，將瘤株進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。接種后第1天檢查培養(yǎng)情況，如無污染，將稱量動(dòng)物體重并隨機(jī)分組后開始給藥。接種后第2天再檢查培養(yǎng)情況，如有污染，則實(shí)驗(yàn)報(bào)廢。,動(dòng)物分組包括實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、受試藥組及陽性對(duì)照藥，均腹腔注射給藥。給藥方案有多種。第20天如果除陽性對(duì)照藥組及受試藥組外再無其他動(dòng)物存活，則終止實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)結(jié)果。第30天處死全部動(dòng)物，并評(píng)價(jià)受試藥的療效。,101,[結(jié)果] 小鼠接種L1210后平均

51、存活8~11d。一般觀察30d，根據(jù)各組動(dòng)物的平均存活天數(shù)，按公式計(jì)算受試藥對(duì)L1210白血病小鼠的生命延長(zhǎng)率（未死亡動(dòng)物按30d計(jì)）。,102,[注意事項(xiàng)] 1.本方法也適用于P388、EAC、Hep、W256和S180等腹水型移植性腫瘤模型。 2.如瘤株培養(yǎng)證明被污染，需重新接種動(dòng)物。,3.接種后第5天給藥組動(dòng)物存活率應(yīng)大于65%，否則說明藥物劑量過大或藥物有毒性。 4.如實(shí)驗(yàn)對(duì)照組動(dòng)物在18d內(nèi)仍未死亡，則認(rèn)為腫

52、瘤生長(zhǎng)不良，接種失敗，應(yīng)分析原因重新實(shí)驗(yàn)。,103,(五)小鼠腎包膜下腫瘤移植模型(×) 在裸鼠、BDF1或CDF1小鼠的腎包膜（腎纖維膜）下移植人的瘤細(xì)胞，由于移植的瘤塊僅1mm3，可由腎包膜下豐富的血管供給營(yíng)養(yǎng)和氧，瘤塊能迅速增長(zhǎng)，短期內(nèi)(6~11d)腫瘤生長(zhǎng)較規(guī)則，接種成活率接近100%。,104,[操作方法] 小鼠腎包膜下異種移植的腫瘤多選用人癌，其來源于裸鼠皮下接種傳代16~22d的人癌瘤株、人癌培養(yǎng)細(xì)胞

53、株或手術(shù)切除的新鮮癌組織。,105,1.在無菌操作下取小鼠或人體瘤組織，剪去包膜及出血壞死部分，切成約1mm3小塊。選用體重18~22g裸鼠、BDF1或CDF1小鼠，麻醉后手術(shù)區(qū)消毒，打開腹腔暴露左腎，將1小塊瘤組織裝入套管針內(nèi)，移植于腎外側(cè)中線處的包膜下。,106,2.在裝有顯微尺的體視顯微鏡下，測(cè)量起始移植塊的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，測(cè)量后關(guān)閉腹部切口。如在腎包膜下注射培養(yǎng)的瘤細(xì)胞株，則注射含1×107個(gè)細(xì)胞的懸液0.02

54、 ml，不必測(cè)量移植瘤塊的長(zhǎng)短徑。,107,3.接種次日分組、給藥，每天給藥1次，共5~10d。停藥次日，即BDF1小鼠接種后6d或裸鼠接種后11d，稱量體重，解剖帶瘤腎臟，在體視顯微鏡下測(cè)量瘤塊的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，按ab2/2公式計(jì)算瘤體積(V)。,4.腫瘤體積(V)也可以用下式計(jì)算：V＝(4/3)πabc＝(1/6)πABC，其中π為圓周率，ABC為腫瘤相互垂直的3個(gè)直徑，abc為腫瘤相互垂直的3個(gè)半徑。,108,109,[結(jié)

55、果計(jì)算] 根據(jù)每只鼠的瘤體積計(jì)算給藥組瘤體積的相當(dāng)率，表示受試藥對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。如給藥治療后瘤體積較原接種瘤體積減小，表示腫瘤消退，受試藥治療有效，以消退率表示：,110,給藥組平均瘤體積相當(dāng)率（%）= ×100% 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組平均瘤體積 給藥后平均瘤體積消退率（%）＝ &#

56、215;100% 原接種平均瘤體積,,,111,[注意事項(xiàng)] 1.手術(shù)切除的人體腫瘤需冰凍運(yùn)送，從取出腫瘤到接種應(yīng)在4 h內(nèi)完成。 2.注意無菌操作，瘤源如有污染，應(yīng)終止實(shí)驗(yàn)。 3.瘤塊接種時(shí)應(yīng)嚴(yán)格使每只鼠瘤塊的長(zhǎng)、短徑控制在0.9~1.2mm。,112,4.應(yīng)嚴(yán)格控制飼養(yǎng)條件和環(huán)境，以免影響動(dòng)物體重增長(zhǎng)而產(chǎn)生非特異性抑瘤作用。 5.若給藥組動(dòng)物體重下降至原體重的70%、實(shí)驗(yàn)終止時(shí)小

57、鼠死亡率超過34%，表示受試藥有毒性，應(yīng)降低劑量重做實(shí)驗(yàn)。,113,114,第六節(jié)抗腫瘤藥物體外研究方法,用體外細(xì)胞作抗癌藥篩選具有用藥量少, 周期短, 費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。體外篩選結(jié)果與體內(nèi)試驗(yàn)的相關(guān)性好, 因此, 抗癌藥體外篩選已作為常規(guī)的抗癌藥初篩手段。,體外研究方法,然而,體外研究方法也有一定局限性，主要是體內(nèi)環(huán)境極為復(fù)雜，與體外實(shí)驗(yàn)環(huán)境有很大差別，體外篩選的最大缺點(diǎn)是無法獲得藥物對(duì)組織選擇性方面的資料。此外, 有些藥物須在體內(nèi)代

58、謝活化 (如環(huán)磷酰胺)或通過機(jī)體反應(yīng)(生物調(diào)節(jié)劑)才能對(duì)腫瘤細(xì)胞起作用, 因而不能通過體外篩選尋找。,體外研究方法,目前世界上已建立了很多體外癌細(xì)胞系(株)。藥物篩選應(yīng)選用生長(zhǎng)特性穩(wěn)定, 增殖快, 對(duì)已知抗癌藥敏感的細(xì)胞系。小鼠與人的細(xì)胞系對(duì)藥物的反應(yīng)大致相同, 前者具有在體內(nèi)外均可進(jìn)行試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn), 故較常應(yīng)用。,體外研究方法,觀察藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制作用，可選擇10~15種以上腫瘤細(xì)胞系(株)進(jìn)行體外研究，受試藥用5個(gè)或5個(gè)以

59、上不同濃度，觀察藥物對(duì)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞存活、細(xì)胞膜功能、生長(zhǎng)曲線、克隆形成能力等指標(biāo)的影響。每項(xiàng)指標(biāo)各有其優(yōu)缺點(diǎn)，因此，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況將幾項(xiàng)指標(biāo)組合起來應(yīng)用。,體外研究方法,一、體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖特性 細(xì)胞生長(zhǎng)是指細(xì)胞體積的增大，細(xì)胞增殖是指細(xì)胞數(shù)目的增多。體外培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)增殖到一定密度時(shí)，則需進(jìn)行傳代(passage)。細(xì)胞每傳一代后，一般要經(jīng)歷潛伏期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和停滯期3個(gè)階段。,體外研究方法,* 在指數(shù)生長(zhǎng)期，取

60、細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)與培養(yǎng)時(shí)間作圖，可得一條斜率向上的直線，故也稱此期為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，約3~5 d,體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞按其生長(zhǎng)方式可分為貼附生長(zhǎng)型和懸浮生長(zhǎng)型兩大類: 貼附生長(zhǎng)型: 細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)能貼附在支持物表面生長(zhǎng)，有時(shí)稱貼壁生長(zhǎng)。,體外研究方法,懸浮生長(zhǎng)型: 細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)不需要附著于支持物而在懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)，如取自血、脾或骨髓的培養(yǎng)細(xì)胞、血白細(xì)胞等。,二、MTT法 [基本原理] MTT是一種溴化四氮唑, FW:414.

61、3, 是能接受氫原子的染料。MTT可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，活細(xì)胞線粒體中脫氫酶在細(xì)胞內(nèi)可將黃色的MTT轉(zhuǎn)化成不溶性的藍(lán)紫色的甲臢, 而死細(xì)胞則無此功能。甲臢的生成量通常與活細(xì)胞數(shù)成正比, 在一定波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(A), 即可定量測(cè)出細(xì)胞的存活率。,MTT,[試劑與器材] 1.MTT溶液 用生理鹽水或PBS配制成5 mg/ml貯存液，在磁力攪拌機(jī)上攪拌30min使之完全溶解。用前通過0.22μm濾膜除菌和沉淀物，4℃避光保存

62、，兩周內(nèi)有效。呈黃色,無沉淀。暫時(shí)不用，可凍存。 2.含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液，不含酚紅指示劑；0.25%胰酶消化液；DMSO原液（分析純）,作為甲臢的溶解液。,MTT,[試劑與器材] 3. 96孔培養(yǎng)板(用新的）,血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，微量移液器，微型振蕩器，CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀。,MTT,[操作步驟] 1.選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼附腫瘤細(xì)胞→0.25%胰酶消化→懸浮于含10%胎牛血清的RPMI16

63、40培養(yǎng)液(完全培養(yǎng)液)→吹打成細(xì)胞懸液。 2.用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè),活細(xì)胞應(yīng)在97%以上。 若是懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞, 可直接用臺(tái)盼藍(lán)排染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞。,MTT,3.96孔培養(yǎng)板每孔加入細(xì)胞懸液190μl，每孔含5000~40000個(gè)細(xì)胞(根據(jù)細(xì)胞的類型而定)。接種后，37℃、5%CO2預(yù)培養(yǎng)24h。 4.將受試藥物配成終濃度的20倍。受試藥可用DMSO、培養(yǎng)液或生理鹽水溶解?？稍O(shè)5~7個(gè)濃度組。,MTT,5.加藥組每孔加入1

64、0μl藥液。因接種的細(xì)胞懸液體積為190μl，又加入了10μl藥液，因此藥液被稀釋了20倍，等于所需要的終濃度。每組設(shè)3~5個(gè)平行孔，最好5個(gè)。 6.細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48h。然后每孔加入5mg/ml的MTT溶液10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h。,MTT,7.小心吸棄孔內(nèi)上清液(若為懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，需1000r/min離心5min后再吸棄上清)。每孔加入150μl DMSO，微型振蕩器上振蕩約10min，使甲臢結(jié)晶完全

65、溶解。,MTT,96孔板用離心機(jī),8.設(shè)置對(duì)照組 ：空白對(duì)照孔(調(diào)零孔)：培養(yǎng)液、MTT和DMSO。 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組：細(xì)胞、相同濃度溶解藥物的溶劑 + 培養(yǎng)液、MTT和DMSO 加藥組 ：細(xì)胞、受試藥物 + 培養(yǎng)液、MTT和DMSO陽性藥對(duì)照組:細(xì)胞、陽性藥 + 培養(yǎng)液、MTT和DMSO （操作步驟同加藥組）,MTT,9.用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)測(cè)定每孔的A值(

66、參考波長(zhǎng)450 nm)。測(cè)定時(shí)以空白對(duì)照孔調(diào)零。應(yīng)盡快完成測(cè)定。,MTT,[結(jié)果評(píng)定]按下式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率：  實(shí)驗(yàn)對(duì)照組平均A值－加藥組平均A值腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)＝ ×100%

67、 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組平均A值,,MTT,以同一樣品的不同濃度藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率作圖可得到劑量反應(yīng)曲線, 從中求出該樣品的半數(shù)抑制濃度IC50,MTT,[評(píng)價(jià)] 本方法已廣泛用于抗腫瘤藥物篩選、一些生物活性因子的活性檢測(cè)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。該方法的特點(diǎn)是靈敏度高、重復(fù)性好、經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)便、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、無放射性污染，且與其他檢測(cè)細(xì)

68、胞存活的方法（如細(xì)胞計(jì)數(shù)法、克隆形成試驗(yàn)和3H-TdR摻入試驗(yàn)等）有良好相關(guān)性。,MTT,[注意事項(xiàng)] 1.MTT被活細(xì)胞中脫氫酶還原所形成的結(jié)晶產(chǎn)物不溶于水，需加入有機(jī)溶劑溶解后才能測(cè)定A值，選擇不同的有機(jī)溶劑或結(jié)晶產(chǎn)物溶解不完全，對(duì)結(jié)果有一定影響。,2.酶標(biāo)儀濾光片的選擇 甲臢的吸收峰受一些因素的影響，如溶解甲臢的溶劑、pH等。因此，首先應(yīng)用優(yōu)質(zhì)分光光度計(jì)測(cè)定實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的最大吸收峰，在此基礎(chǔ)上選擇合適的濾光片。,MTT,3.細(xì)

69、胞系的選擇及接種的細(xì)胞數(shù) 由于實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)計(jì)在活細(xì)胞數(shù)與A值呈線性關(guān)系部分進(jìn)行，故應(yīng)選用在4~7d生長(zhǎng)速度適合作此項(xiàng)分析的細(xì)胞系。選擇適量接種細(xì)胞數(shù)的原則是，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的A值與活細(xì)胞數(shù)之間仍處于線性范圍（一般A值在0.2~2.0之間）。,4.甲臢的生成不僅與活細(xì)胞數(shù)成正比，也受加入MTT后作用時(shí)間的影響，即A值可隨著放置時(shí)間而改變。,MTT,5.培養(yǎng)液中的酚紅、人血清蛋白、免疫球蛋白和某些添加劑可使A值增高。在進(jìn)行MTT