蛋白激酶PLK1的分子動(dòng)力學(xué)模擬和藥物設(shè)計(jì)、核受體PXR的分子對(duì)接研究.pdf

1、保羅樣激酶(Polo-1ike kinase，簡稱PLK)是一個(gè)與細(xì)胞周期的調(diào)控緊密相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，在有絲分裂(mitosis)的各個(gè)時(shí)期以及細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)響應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。在PLK的各家族成員中，PLK1的異常表達(dá)常常與腫瘤形成相關(guān)，并已經(jīng)在多種類型的癌癥中被檢測(cè)到。因此，研究PLK1的分子生物學(xué)和調(diào)節(jié)功能有助于揭示PLK1在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中扮演的角色以及它的激活與腫瘤形成之間的關(guān)系。論文的第一章綜述了PLK1的分子生

2、物學(xué)研究進(jìn)展，包括PLK1在細(xì)胞周期中的作用、結(jié)構(gòu)域以及相應(yīng)的功能、與癌癥的關(guān)系、在藥物開發(fā)中的價(jià)值以及目前在抑制劑開發(fā)研究中的一些進(jìn)展。由于它在有絲分裂調(diào)節(jié)中的特定角色，PLK1被認(rèn)為是一個(gè)癌癥治療的潛在靶標(biāo)。
　　 生物化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在PLK1的激酶結(jié)構(gòu)域和保羅盒結(jié)構(gòu)域之間存在著一種分子內(nèi)抑制作用，它對(duì)于PLK1的激酶活性調(diào)節(jié)有著重要的意義。同時(shí)，在激酶結(jié)構(gòu)域上Thr210的磷酸化或者一段磷酸化小肽與PBD的結(jié)合都能解除這種

3、抑制作用?；谶@種現(xiàn)象，有人提出了一種PLK1的調(diào)節(jié)機(jī)理假說，認(rèn)為磷酸化小肽與PBD的結(jié)合在KD-PBD的結(jié)合界面上誘導(dǎo)產(chǎn)生了某種未知的構(gòu)象變化，從而導(dǎo)致PLK1的分子內(nèi)相互作用被破壞。為了探討KD和PBD的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)及其對(duì)分子內(nèi)的活性調(diào)節(jié)的影響，我們利用各種計(jì)算方法包括同源模建、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)和構(gòu)象主成分分析等，深入研究了PLK1的分子內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)理。這部分內(nèi)容在論文第二章進(jìn)行了詳細(xì)的描述。動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果顯示，KD和PBD都

4、分別擁有兩種狀態(tài)。在Thr210上的磷酸化使KD穩(wěn)定在關(guān)閉的狀態(tài)，而未磷酸化的KD在激活槽區(qū)是打開的，而只有未磷酸化的KD能與PBD結(jié)合。PBD則在兩種不同的構(gòu)象之間互相變換，這兩種構(gòu)象的主要區(qū)別在于PB1和PB2的相對(duì)取向不同，分別對(duì)應(yīng)于PBD的打開和關(guān)閉狀態(tài)。同時(shí)，我們還觀察到磷酸化小肽與PBD的結(jié)合能夠中斷這種開合運(yùn)動(dòng)，使PBD的構(gòu)象鎖定在關(guān)閉狀態(tài)。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對(duì)接結(jié)果揭示了打開狀態(tài)的KD和關(guān)閉狀態(tài)的PBD以一種相當(dāng)有趣的方式互

5、相結(jié)合，其中KD的激活槽區(qū)緊扣PBD的L2連接，而PBD的磷酸化小肽結(jié)合口袋則被KD的一段螺旋α C所占據(jù)，形成一個(gè)所謂的“雙向咬合”的結(jié)合模式。這種結(jié)合模式較好地解釋了PBD對(duì)KD的激酶活性抑制現(xiàn)象，以及磷酸化小肽如何破壞這種分子內(nèi)的相互作用?；谖覀兊哪M結(jié)果和分析，我們提出了一種原子水平上的KD-PBD之間的分子內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)理。首先，KD的磷酸化狀態(tài)決定了它有兩種不同的構(gòu)象，Thr210磷酸化時(shí)，KD的構(gòu)象是關(guān)閉并且活性的；在Thr2

6、10未磷酸化時(shí)，KD的構(gòu)象是打開并且非活性的。第二，PBD也有兩種不同的狀態(tài)，分別對(duì)應(yīng)關(guān)閉狀態(tài)和打開狀態(tài)。磷酸化小肽的結(jié)合能夠?qū)BD穩(wěn)定在關(guān)閉的狀態(tài)。第三，打開狀態(tài)的KD與關(guān)閉狀態(tài)的PBD結(jié)合，從而抑制激酶的催化活性和PBD的磷酸化小肽結(jié)合能力。該研究在原子水平上為揭示PLK1的分子內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)理提供了一些有意義的線索和結(jié)論。分子動(dòng)力學(xué)模擬清晰地描述了KD和PBD在各種不同條件下的動(dòng)態(tài)特征。大量的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象驗(yàn)證了我們的KD-PBD結(jié)合模型，

7、反過來肯定了我們模擬手段的正確性。該研究可能有助于指導(dǎo)新穎的PLK1抑制劑的發(fā)現(xiàn)與設(shè)計(jì)。
　　 近年來陸續(xù)有一些PLK1的激酶抑制劑被發(fā)現(xiàn)，這些抑制劑中的大多數(shù)對(duì)PLK1的激酶活性顯示出較強(qiáng)的抑制能力。但是，由于ATP結(jié)合口袋的高度保守性，這些抑制劑對(duì)PLK1的選擇性普遍較差。尋找作用于其它位點(diǎn)的抑制劑應(yīng)該可以改善抑制劑的選擇性。在論文的第三章，我們以PBD的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，建立了兩個(gè)虛擬篩選模型，分別對(duì)SPECS和ACD兩個(gè)化

8、合物庫進(jìn)行搜索，以發(fā)現(xiàn)新型的PLK1抑制劑。后處理程序包括一致性打分，類藥性評(píng)價(jià)，藥物化學(xué)家的建議等等，都被用來對(duì)候選化合物進(jìn)行精簡。最后對(duì)SPECS和ACD庫分別購買了大約65和32個(gè)化合物。生物活性測(cè)試表明有超過七個(gè)候選化合物可以與PBD結(jié)合，其結(jié)合常數(shù)(Kd)均在μM級(jí)別。在這些候選化合物中，有一個(gè)化合物可以在細(xì)胞水平有效抑制小鼠白血病細(xì)胞P388的生長，其抑制的IC50值為3.33μ M。這個(gè)結(jié)果是十分令人振奮的，對(duì)于將宋的抗白

9、血病藥物開發(fā)可能具有指導(dǎo)意義。
　　 人類孕甾核受體是配體激活轉(zhuǎn)錄因子核受體家族成員之一，它是哺乳動(dòng)物中細(xì)胞色素酶P450-3A基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子。PXR能被大多數(shù)誘導(dǎo)CYP3A4基因表達(dá)的化合物所激活，并且它的激活與許多不利的藥物-藥物相互作用緊密相關(guān)。為了研究PXR配體結(jié)合位點(diǎn)上對(duì)于激活至關(guān)重要的結(jié)構(gòu)特征，我們利用PXR的四個(gè)晶體結(jié)構(gòu)，對(duì)30多個(gè)結(jié)構(gòu)不同的PXR激動(dòng)劑和拮抗劑進(jìn)行了一系列分子對(duì)接研究。研究結(jié)果在論文的第四章