MDR逆轉(zhuǎn)劑高通量篩選模型的建立和應(yīng)用.pdf

1、腫瘤多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞對多種結(jié)構(gòu)和功能完全不相關(guān)的藥物產(chǎn)生抗性的現(xiàn)象，是目前腫瘤化療成功的主要障礙之一。許多腫瘤對化療藥物具有先天的抵抗作用，而其它一些癌癥在接受化療后也會(huì)產(chǎn)生獲得性耐藥現(xiàn)象，這種多藥耐藥現(xiàn)象會(huì)減輕大多數(shù)化療藥物的藥效，成為了臨床化療成功的瓶頸。因此，腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的研究與開發(fā)已成為抗腫瘤研究的首要任務(wù)。 臨床出現(xiàn)的腫瘤多藥耐藥由多種因素所導(dǎo)致：在機(jī)體水平上，人體對藥物的吸收、分布、代謝及消除特性會(huì)引起藥效

2、的降低；在組織水平上，腫瘤組織特殊的幾何結(jié)構(gòu)、通透性及其周圍特殊的酸性環(huán)境也會(huì)阻止藥物進(jìn)入腫瘤組織；在細(xì)胞水平上，藥物靶蛋白的突變、代謝通路的改變及解毒蛋白的高表達(dá)也會(huì)使腫瘤細(xì)胞逃避化療藥物的殺傷，在細(xì)胞水平多藥耐藥中，由于腫瘤細(xì)胞高表達(dá)ABC蛋白家族的成員蛋白并通過外排泵作用降低胞內(nèi)藥物濃度所引起的多藥耐藥現(xiàn)象被稱為經(jīng)典腫瘤多藥耐藥。在過去的幾十年中，人們對腫瘤多藥耐藥的研究一直集中于對經(jīng)典多藥耐藥的研究。 P-gp是第一個(gè)被

3、證明能引起經(jīng)典多藥耐藥的外排泵蛋白，隨后，MRP、BCRP等ABC蛋白家族蛋白也相繼被證明與經(jīng)典多藥耐藥相關(guān)。而P-gp一直是研究最深入的蛋白，也是腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑開發(fā)的主要靶點(diǎn)。迄今為止，以P-gp蛋白的外排功能為靶點(diǎn)的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑已經(jīng)經(jīng)歷了三代歷程，包括鈣離子通道阻滯劑、鈣調(diào)蛋白抑制劑、免疫抑制藥物等P-gp功能抑制劑，但由于毒副作用和交叉藥代動(dòng)力學(xué)反應(yīng)等因素臨床效果不佳，并未開發(fā)出理想的逆轉(zhuǎn)劑上市；近幾年，越來越多的學(xué)者關(guān)注于

4、P-gp編碼基因mdrl的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，希望在轉(zhuǎn)錄水平抑制P-gp的高表達(dá)降低P-gp的外排作用以逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥。 本研究的目的是以mdrl基因啟動(dòng)子和P-gp蛋白為靶點(diǎn)，基于報(bào)告基因技術(shù)和熒光染料胞內(nèi)積累實(shí)驗(yàn)技術(shù)建立穩(wěn)定性好、靈敏度高的腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑高通量篩選模型，為腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的高通量篩選工作建立平臺(tái)，并對中藥樣品庫進(jìn)行高通量篩選，尋找具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥活性的中藥樣品。在P-gp蛋白功能抑制劑篩選模型中，培養(yǎng)P-g

5、p高表達(dá)的MCF-7/ADM多藥耐藥抗性細(xì)胞株，用熒光染料Rho123為指示劑檢測P-gp外排功能情況以計(jì)算樣品對P-gp蛋白功能的抑制活性，并對中藥樣品庫進(jìn)行了高通量篩選，再用劑量一活性依賴實(shí)驗(yàn)和抗性增敏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證陽性樣品的活性；在mdrl啟動(dòng)子抑制劑篩選模型中，首先以人肝癌細(xì)胞：HepG2基因組為模板，PCR擴(kuò)增mdrl啟動(dòng)子-434-+158區(qū)，構(gòu)建mdrl-luc+重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染HepG2中，通過檢測啟動(dòng)子下游熒光素酶報(bào)告基因的

6、表達(dá)情況計(jì)算樣品對啟動(dòng)子的抑制活性，并對中藥樣品庫進(jìn)行了高通量篩選，再用劑量依賴實(shí)驗(yàn)和RT-PCR驗(yàn)證陽性樣品的活性。 經(jīng)過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，P-gp蛋白功能抑制劑篩選模型Z’因子為0.72，mdrl啟動(dòng)子抑制劑篩選模型Z’因子為0.65，證明模型穩(wěn)定性好、靈敏度高。通過對中藥樣品庫的篩選，分別鑒定兩種中藥樣品具有較高的體外活性。 本研究工作為腫瘤逆轉(zhuǎn)劑的篩選與開發(fā)建立了平臺(tái)，使腫瘤逆轉(zhuǎn)劑的大規(guī)模高通量篩選成為可能。然而，更新更