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文檔簡介
1、細(xì)胞外基質(zhì)是由細(xì)胞分泌到細(xì)胞外間質(zhì)中的多糖、蛋白質(zhì)和蛋白聚糖等大分子物質(zhì)構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)架結(jié)構(gòu),其不僅能夠維持正常組織的結(jié)構(gòu)與功能,還在細(xì)胞增殖、生長和分化過程中起著非常重要的作用?;|(zhì)金屬蛋白酶是一類依賴Zn2+的肽鏈內(nèi)切酶,是參與細(xì)胞外基質(zhì)降解和重構(gòu)的關(guān)鍵酶之一,這一過程對于細(xì)胞的增殖與分化、細(xì)胞凋亡、血管生成和胚胎發(fā)育非常關(guān)鍵?;|(zhì)金屬蛋白酶不但能切割細(xì)胞外基質(zhì)的各種組成成分,而且還能降解其它蛋白酶、細(xì)胞外受體、生長因子、趨化因子、細(xì)
2、胞因子結(jié)合蛋白等物質(zhì),所以,基質(zhì)金屬蛋白酶參與了許多重要的生理和病理過程。體內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)水平和活性的升高與癌癥的發(fā)生與轉(zhuǎn)移、粥狀動脈硬化的形成、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和敗血癥的惡化等有著緊密的關(guān)系,已經(jīng)證明基質(zhì)金屬蛋白酶家族的一些成員是治療上述疾病的藥物靶點(diǎn)。所以對基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的研究與開發(fā)對于治療癌癥、粥狀動脈硬化、神經(jīng)退行性疾病和敗血癥等疾病具有重要的意義。
基質(zhì)金屬蛋白酶由疏水信號肽序列、前肽區(qū)、催化結(jié)構(gòu)域、
3、富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)和羧基末端區(qū)5部分組成,其中單獨(dú)的催化結(jié)構(gòu)域與完整蛋白酶的催化活性相似。本實(shí)驗(yàn)利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)MMP-3的催化結(jié)構(gòu)域蛋白和MMP-8的催化結(jié)構(gòu)域蛋白,并通過Ni-NTA親和層析柱和肝素親和層析柱對重組蛋白進(jìn)行了純化,得到了可用于高通量藥物篩選的蛋白。利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法測定了重組蛋白的活性,選定了合適的底物濃度和蛋白濃度,從而建立了穩(wěn)定的高通量藥物篩選體系,為以后的MMP-3和MMP-8的高通量藥物篩選奠
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