MC1R天然拮抗劑的高通量篩選及其作用機制初探.pdf

1、人類皮膚的顏色主要取決于黑色素的合成和分布。agouti與extension早已被認為是控制哺乳動物毛皮中真、偽黑色素相對數(shù)量與分布的基因座。其中，extension 基因座編碼促黑激素受體1(MClR)，是對哺乳動物皮毛顏色起決定作用的關(guān)鍵調(diào)控產(chǎn)物。MClR可與垂體前部釋放的促黑激素(α-MSH)或腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)結(jié)合，引起cAMP水平的提高，cAMP進一步激活酪氨酸激酶(TYR)及其相關(guān)蛋白TYR-1(又稱：多巴色素互變酶

2、)、TYR-2(又稱：DCT/DHICA氧化酶)，它們催化黑色素細胞從血液中攝取的酪氨酸，經(jīng)高爾基復(fù)合體變成多巴及多巴醌，最后合成真黑色素，是皮膚黑色素的主要組分；多巴醌還可通過另一途徑經(jīng)谷光甘肽或半胱氨酸催化生成紅或黃色的褐黑素(Phaeomelanin)。 由于MClR在黑素的生成和調(diào)節(jié)方面起的重要作用，她日漸成為皮膚病治療上的研究熱點。越來越多的人開始研究和探索有效的激動劑和拮抗劑。目前，關(guān)于MClR基因拮抗劑鮮有報道，大

3、多都是合成的肽類或類似化合物，可用于臨床試驗的更是少數(shù)。所以尋找發(fā)現(xiàn)更有效的化合物或藥物原料迫在眉睫。 在本實驗驗采用的穩(wěn)定表達人MClR-熒光素酶的中國倉鼠卵巢細胞系 MClR-6CRE-Luci-CHO(MClR)和僅含有相應(yīng)報告基因的宿主細胞系 6CRE-Luci-CHO(Host)中，均采用置于CRE下游的，對cAMP信號極為敏感的熒光素酶報道基因置換酪氨酸酶基因，所以，利用熒光素酶活性的變化就能夠極為方便、高效、靈敏地

4、反映出CRE的調(diào)控活性，從而推斷在相同條件下酪氨酸酶基因的表達情況。 首先，我們對此重組細胞株模型進行優(yōu)化，luciferin熒光素為底物，NDP-a-MSH為激活劑標準品，Sepiwhite 為拮抗劑標準品，用SPSS及Graphpad軟件進行數(shù)據(jù)處理，對其主要參數(shù)進行優(yōu)化。最后選擇的條件參數(shù)為：NDP-a-MSH濃度0.5 nMol/L；Sepiwhite 濃度25 μMol/L；孵育時間5h；熒光素用量從廠商推薦的100μ

5、L降到25μL。本體系能夠?qū)ClR拮抗/激動劑類藥物進行高通量篩選及其作用靶點進行初步判斷(MClR或cAMP)。利用我們優(yōu)化后的細胞篩選模型和方法對2000多種中草藥提取物進行了高通量篩選。共得到了對MSH作用抑制率達到60％以上，且細胞活力在80％以上的參試粗提物10種，這10種提取物同時檢測了在相應(yīng)Host細胞中對于Forskolin作用的抑制率。結(jié)果表明：補骨脂提取物能明顯抑制MSH的作用(82.23％)，其抑制率接近于標準品

6、陽性對照(85.11％)，而對于Forskolin作用的抑制率僅為22.15％，其差值達近60％，說明其抑制作用在很大程度上不是直接作用于cAMP而是作用于MSH對MClR的激活過程；而其余9種提取物的對于MSH和對于Forskolin的抑制作用率都比較接近，表明它們基本上直接作用于cAMP通路而不是作用于MSH對MClR的激活過程。 實驗還檢測了這些提取物對小鼠B16-F1細胞系黑色素生成量的影響。其中，補骨脂、破莖松蘿、桑根