基于雙報(bào)告基因的α1-AR亞型選擇性拮抗劑高通量篩選模型的建立及應(yīng)用.pdf

1、良性前列腺增生（Benign prostatic hyperplasia，BPH）是一種中老年男性常見的疾病，主要表現(xiàn)為增生部分?jǐn)D壓尿道，導(dǎo)致包括下尿路梗阻（LUTS）在內(nèi)的一系列排尿障礙癥狀。BPH以其較高的發(fā)病率及潛在導(dǎo)致各種并發(fā)癥的可能性，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量，如不及時(shí)治療，甚至可能危及患者的生命。α1-腎上腺素受體（α1-adrenegic receptor，α1-AR）是G蛋白偶聯(lián)受體家族（GPCRs）的成員之一。一般將α

2、1-AR分為3種亞型：α1A-AR、α1B-AR和α1D-AR。研究發(fā)現(xiàn)，人體前列腺組織中的α1-AR主要為α1A-AR（63％）,α1D-AR次之（31%），而以α1B-AR所占比例最少（6%）。拮抗α1A-AR可從根本上緩解尿路梗阻癥狀，拮抗α1D-AR可以改善逼尿肌功能失調(diào)的刺激性和灌注性排泄癥狀，而α1B-AR將可能產(chǎn)生嚴(yán)重的心血管副作用。選擇性作用于α1A-AR和α1D-AR而對α1B-AR弱拮抗或不拮抗的選擇性α1-AR拮抗

3、劑，可有效降低病變前列腺平滑肌張力的同時(shí)盡量規(guī)避產(chǎn)生副作用的風(fēng)險(xiǎn),以此減輕BPH導(dǎo)致的尿道梗阻癥狀。
　　藥物的高通量篩選技術(shù)（High throughput screening，HTS）是近年來在藥學(xué)領(lǐng)域興起的一種新型篩選模式。作為一種研究藥物活性成分以及活性化合物初期發(fā)現(xiàn)和篩選的核心方法，HTS正被越來越多地應(yīng)用于各種藥理研究實(shí)驗(yàn)和藥物篩選平臺。它是利用藥靶分子或細(xì)胞水平的生物學(xué)機(jī)制，以微孔板為基礎(chǔ)，進(jìn)行大量大規(guī)模篩選的技術(shù)，

4、以期找到能高選擇性地作用于藥物作用靶點(diǎn)的具有一定生物化學(xué)活性的目標(biāo)化合物。這一方法易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作且高效快捷，適用性廣，可與多種初步篩選技術(shù)搭載聯(lián)用，大大提升了初篩技術(shù)的藥物篩選規(guī)模和應(yīng)用價(jià)值，能在最短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的批量篩選。
　　本人所在課題組在抗良性前列腺增生領(lǐng)域做了大量工作，課題組前期展開了大量合成工作，已建立起芳基哌嗪類化合物庫，在庫化合物277個(gè)，迫切需要建立一個(gè)高通量篩選方法，快速高效的對化合物進(jìn)行篩選。由

5、于α1-AR的其中兩種亞型（α1A/D-AR）提供了在治療良性前列腺增生（BPH）方面的重要靶點(diǎn)作用，基于GPCRs的信號通路特點(diǎn)，我們分別以α1(A/B/D)-AR受體為藥物作用靶點(diǎn)，建立了體外針對α1-AR亞型選擇性拮抗劑的藥物高通量篩選模型，擬從中獲得效果明確、選擇性高且副作用低的α1A/D-AR拮抗劑。
　　我們將構(gòu)建好的α1-AR目的基因質(zhì)粒（ADRA1A、ADRA1B和ADRA1D）分別與報(bào)告基因質(zhì)粒CRE-LUC、內(nèi)

6、參質(zhì)粒pRL-SV40共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，加入相應(yīng)的α1-AR拮抗劑，通過檢測胞內(nèi)雙熒光素酶報(bào)告基因的相對表達(dá)水平來達(dá)到篩選所需α1-AR拮抗劑的目的。同時(shí)，我們還從細(xì)胞匯合度、脂質(zhì)體含量、實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因載體類型、三種載體基因DNA含量之比、轉(zhuǎn)染持續(xù)時(shí)間以及所添加藥物化合物的終濃度、作用時(shí)間、細(xì)胞裂解時(shí)間等方面對這一篩選模型進(jìn)行了相關(guān)優(yōu)化并考察了該模型的穩(wěn)定性因素。
　　結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)藥物篩選模型的最佳實(shí)驗(yàn)條件最終確定為：采用

7、HEK293細(xì)胞為受試細(xì)胞株；瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合度為80%-90%；采用CRE-LUC作為實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因；三種載體質(zhì)粒DNA含量之比為1：1：1；采用脂質(zhì)體2000作為瞬轉(zhuǎn)介導(dǎo)工具；轉(zhuǎn)染后18h左右進(jìn)行給藥刺激；對于細(xì)胞培養(yǎng)板中的每個(gè)孔，DMSO添加終濃度百分比為1%，其他藥物化合物終濃度均為10-5mol/L；藥物作用時(shí)間為8-10h；細(xì)胞裂解時(shí)間為40min；檢測最佳條件：每個(gè)測試孔添加一定體積細(xì)胞內(nèi)容液，自動(dòng)添加25μL/孔LAR