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文檔簡介
1、本課題建立了hPXR介導(dǎo)的UGT1A1的報(bào)告基因模型,并成功地將之應(yīng)用于體外誘導(dǎo)研究,從多種中藥單體中篩選獲得能通過hPXR途徑誘導(dǎo)UGT1A1的潛在誘導(dǎo)劑,并在UGT1A1的RNA和蛋白質(zhì)水平上對(duì)多種中藥單體的誘導(dǎo)效應(yīng)進(jìn)行了驗(yàn)證。
目的建立基于hPXR的UGT1A1的報(bào)告基因模型,研究多種中藥提取物和中藥單體通過hPXR途徑對(duì)UGT1A1的潛在誘導(dǎo)能力,并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。
方法以人基因組DNA為模板擴(kuò)增UGT
2、1A1的遠(yuǎn)端啟動(dòng)子和近端啟動(dòng)子,連接到含報(bào)告基因的pGL3載體上,構(gòu)建pGL3-PXRE報(bào)告基因重組質(zhì)粒,并與hPXR表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,從而建立hPXR介導(dǎo)的UGT1A1的雙熒光素酶報(bào)告基因模型。運(yùn)用該模型考察9種常見中藥和114種中藥單體對(duì)hPXR的激活作用,即對(duì)UOT1A1的潛在誘導(dǎo)作用,從中篩選出激活作用較高的中藥單體,最后采用real-timePCR和western-blotting的方法從RNA和蛋白質(zhì)水平上對(duì)這些
3、中藥單體的誘導(dǎo)效應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。
結(jié)果將UGT1A1遠(yuǎn)端啟動(dòng)子和近端啟動(dòng)子片段克隆到含報(bào)告基因的pGL3載體上,構(gòu)建了pGL3-PXRE重組質(zhì)粒,并與hPXR表達(dá)質(zhì)粒和內(nèi)參熒光素酶質(zhì)粒pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,成功構(gòu)建了基于hPXR的用于研究UGT1A1誘導(dǎo)作用的雙熒光素酶報(bào)告基因模型,并考察了9種常見中藥的提取物和114種中藥單體通過hPXR途徑對(duì)UGT1A1的潛在誘導(dǎo)效應(yīng),篩選得到南五味子、白術(shù)和川芎3種提取物
4、,黃酮類單體白楊素和芹菜素,丹參的活性成分丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和隱丹參酮,五味子的活性成分五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲和五味子酯甲,銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏酸(17:1),胡椒堿、鉤藤堿、文多靈、吳茱萸次堿、金絲桃素、蒿甲醚和冬凌草甲素這20種中藥單體的誘導(dǎo)效應(yīng)為陽性對(duì)照利福平的70%以上,提示它們可以通過hPXR途徑對(duì)UGT1A1的產(chǎn)生不同程度的誘導(dǎo)作用。利用real-timePCR和westem-blottin
5、g的方法對(duì)UGT1A1的RNA和蛋白質(zhì)變化進(jìn)行考察,驗(yàn)證了這20種中藥單體中白楊素、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、金絲桃素和吳茱萸次堿這幾種中藥單體可誘導(dǎo)UGT1A1的RNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)。
結(jié)論成功建立了基于hPXR的UGT1A1的報(bào)告基因模型,為hPXR激活劑的體外篩選提供了一種有效的方法。利用該模型篩選得到多種對(duì)UGT1A1有一定誘導(dǎo)作用的中藥單體,并從RNA和蛋白質(zhì)水平進(jìn)行了驗(yàn)證,提示這些化合物與UGT1A1代
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