高通量基因篩選技術的應用及優(yōu)化.pdf

1、研究目的:基因表達是一個復雜而精細的網絡調控過程，細胞的生物學功能是在特定時間和空間里，多種基因表達及相互調控的結果。明確細胞在生理與病理條件下的基因表達及其調控的差異，將對細胞生理與病理狀態(tài)的干預提供極大幫助。隨著測序技術和基因組學的不斷發(fā)展，越來越多的高通量基因篩選技術應運而生。相比之下，基因表達序列分析技術(SAGE)技術可以將細胞在特定功能狀態(tài)下全轉錄組中每一條mRNA轉化為最簡單的10bp的標簽形式，并通過后續(xù)的一系列操作對標

2、簽進行定性定量，具有高通量、高敏感性、可定量和可以發(fā)現新基因的優(yōu)點，已被廣泛用于特定細胞在特定功能狀態(tài)下的轉錄組研究。因此，闡明應用SAGE技術進行疾病基因組研究時的優(yōu)勢和問題，將對未來選擇SAGE技術進行疾病研究具有指導意義。
　　 同種移植排斥是器官移植失敗的主要原因，而CD4+T細胞在這一過程中具有重要作用。隨著對不同亞群CD4+T細胞在同種移植排斥或耐受過程中作用研究的不斷深入，發(fā)現單一研究某種基因或目前已知的某類分子已

3、經很難解釋各CD4+T細胞亞型間復雜的相互作用及它們在移植中的行為方式。非常有必要在基因組水平研究它們彼此之間基因表達的差異，及其在移植排斥和耐受中基因表達的特點，因此，在基因組水平發(fā)現更多CD4+T細胞特異的移植相關基因將對分析不同CD4+T細胞亞型在移植過程中的作用和相互調節(jié)具有重要意義。因此，本研究第一部分選擇構建同種移植排斥相關CD4+T細胞SAGE文庫，并通過該文庫的構建分析應用SAGE技術進行疾病差異表達基因研究時所應注意的

4、問題。盡管SAGE技術已被廣泛用于基因組結構和功能的研究。但是，由于SAGE技術本身的原因所造成的SAGE標簽基因匹配的低特異性使得對標簽的基因確定成為SAGE研究的最大難題。盡管后來出現的結合標簽的基因序列延伸技術(GLGI)將SAGE標簽轉化為較長的3’EST片段用于cDNA模板的確定，但結果仍不理想。且這兩種技術的操作流程非常復雜，不適合用于大規(guī)模樣本，如腫瘤樣本的研究。因此需要進一步探討高通量基因篩選的新技術，為在基因組水平深入

5、研究疾病基因奠定實驗基礎。
　　 隨著下一代測序(Next-Generation Sequencing)技術的出現，已經涌現出一些新的基因組學研究技術，如雙標簽基因組掃描(DGS)技術，它可以較準確的在kb分辨率水平發(fā)現正常群體基因組的相似性和差異性，確定病理情況下，如腫瘤基因組的插入、轉位、缺失、易位等異常。然而，其復雜的操作流程卻嚴重的限制了它在大規(guī)模疾病基因組研究中的應用。因此，需要以新的測序儀為平臺，對DGS技術進行改良

6、。課題的第二部分即對原有DGS技術進行改良，相繼建立了改良的體內DGS技術和簡化的體外DGS技術，旨在為疾病基因組的大規(guī)模研究提供新的高通量基因篩選工具。然而，盡管簡化的體外DGS技術在實驗流程和基因組檢測效率上有了很大程度的提高，但16bp的可選序列有時無法提供較好的引物設計參考區(qū)域，因而可能影響對目的基因進行PCR擴增的效率和特異性。為此，論文的第三部分建立了限制性片段全基因組掃描技術，它是在下一代測序平臺的測序能力進一步提高的基礎

7、上產生的，旨在更好的發(fā)揮DGS技術等末端配對測序技術的優(yōu)點并進一步簡化樣本制作過程，使得大規(guī)模基因組測序更為常規(guī)化。
　　 研究方法:
　　 第一部分同種移植排斥CD4+T細胞SAGE文庫的構建及分析
　　 本研究應用SAGE技術建立同種移植及同系移植組CD4+T細胞mRNA標簽庫。通過統(tǒng)計學分析確定CD4+T細胞同種移植排斥相關低拷貝標簽，并通過NCBI SAGEmap可信數據庫比對和GLGI技術進一步確定同種

8、移植CD4+T細胞相關基因。通過實時定量RT-PCR擴增部分顯著差異標簽，比較兩種方法在發(fā)現差異表達基因方面的敏感性。通過與cDNA微陣列研究結果的比較，分析SAGE技術與cDNA微陣列技術的差異和互補性。
　　 第二部分 DGS技術的優(yōu)化及應用
　　 本研究對原有DGS技術進行改良，相繼建立了改良的體內DGS技術和簡化的體外DGS技術。改良的體內DGS技術對原DGS流程中后兩步的質粒文庫構建進行改進，分別是：1、應用M

9、HM pZErO-1質粒上的M13引物位點PCR釋放ditags取代原方法中ditags質粒擴增后酶切釋放ditags。2、用Solexa測序儀直接測序ditags取代原方法中質粒擴增454測序連接體的步驟。簡化的體外DGS技術則設計了PstⅠ-MmeⅠ-Solexa adaptor，用adaptor與基因組片段的體外連接取代了原DGS技術中三步質粒文庫構建過程，通過白血病細胞系Kasumi-1基因組DNA檢測該技術的可行性，并成功應用

10、簡化的體外DGS技術制備了8個家族性乳腺癌患者基因組PstⅠ ditags文庫。
　　 第三部分限制性片段全基因組掃描技術的建立及其應用
　　 計算機模擬分析130種限制性酶切位點在人類HG18參考基因組中的分布特點及限制性片段測序全基因組掃描技術的可行性。應用用FatⅠ(/CATG)和Tsp509Ⅰ(/AATT)相繼酶切基因組DNA制備CATG-AATT限制性片段。用T4 DNA聚合酶補平酶切產生的5’凸出粘性末端。應

11、用無3’→5’外切酶活性的Klenow片段限制性片段3’末端加“A”。與3’末端含有"T"的Solexa adaptors連接。瓊脂糖凝膠電泳純化連接產物，去掉adaptor自身二聚體。PCR擴增adaptor-DNA-adaptor片段。利用adaptor上的測序引物進行Solexa測序，每段片段讀取兩端各35～75bp序列。
　　 結果:
　　 第一部分同種移植排斥CD4+T細胞SAGE文庫的構建及分析
　　

12、 共得到同種移植組51808個和同系移植組51644個標簽序列，分別代表同種移植組13726個和同系移植組13386個獨特轉錄本。統(tǒng)計分析確定402個(拷貝數均<50)明顯差異表達(p<0.05，差異倍數>=3)SAGE標簽。通過比對NCBISAGEmap可信數據庫和GLGI技術，本研究共確定同種移植排斥和耐受相關的97個上調基因和88個下調基因。采用實時定量RT-PCR技術驗證其中5個基因的表達差異特點，發(fā)現利用該技術分析同種移植和同

13、系移植組的差異基因表達趨勢同SAGE結果相同，但實時定量RT-PCR技術對低拷貝下調表達基因的檢測敏感性較差。通過與10個移植相關的基因組研究結果比較，發(fā)現SAGE技術能夠較全面的發(fā)現差異表達基因，且重復性較高，能夠發(fā)現新的轉錄本剪接體和異構體，而cDNA微陣列技術較SAGE技術更加特異，二者具有互補性。
　　 第二部分 DGS技術的優(yōu)化及應用
　　 成功創(chuàng)建了基于Solexa和Solid測序技術的優(yōu)化的體內DGS技術和

14、簡化的體外DGS技術。與之前基于454測序技術的體內DGS技術相比，新的DGS技術具有以下優(yōu)點：1)原DGS技術應用454測序儀，其測序能力在100Mb水平，簡化的體外DGS技術應用Solexa或SOLiD測序儀，其測序能力在Gb水平。測序能力的提高使得DGS技術掃描基因組的覆蓋度增加，可以收集更高頻率酶切基因組DNA后產生的ditags從而增加基因組掃描的分辨率，還可以避免454測序時對均聚物中堿基數辨識不清的問題。2)454測序技術

15、每次讀取的DNA序列長度為100～2501bp，要求將大約36bp的ditags串聯(lián)后測序。而Solexa和Solid每讀為36bp，可對體外DGS產生的ditags直接測序，這一改進很大程度的簡化了DGS流程。3)用限制性內切酶PstⅠ替換之前的SacⅠ和HindⅢ，進一步提高了DGS技術對基因組掃描的覆蓋度和分辨率。4)體外DGS技術僅需要體外adaptor連接即可完成，將實驗周期由1～2周縮短為1～2天。因此，簡化的流程使得進行大

16、規(guī)?；蚪M掃描成為可能。應用簡化的體外DGS技術成功構建了8個乳腺癌Pst1-Solexa-Ditags文庫。測序結果表明，ditags兩端均包含設計PstⅠ-MmeⅠ-Solexa adaptor時已明確的末端序列"TGCAG"和"TGCAA"，序列長度也與MmeⅠ的酶切特點相符，并完全排除了adaptor二聚體對測序結果的干擾。表明簡化的體外DGS技術完全可以用于進行大規(guī)模疾病基因組的研究。
　　 第三部分限制性片段全基因組

17、掃描技術的建立及其應用
　　 應用人類HG18基因組序列信息為模型，通過計算機模擬分析了基于Solexa測序技術的限制性片段測序全基因組掃描技術的可行性。結果顯示限制性片段測序全基因組掃描技術與目前所用的隨機片段測序技術相比，所需的測序規(guī)模更小、數據分析更簡單、可以根據對測序分辨率的需要選擇不同的限制性內切酶、并且還可以用于基因組結構的分析及基因組物理圖譜的建立。與之前建立的限制性片段測序的DGS技術相比，其對基因組掃描的覆蓋度

18、更寬、分辨率更高、樣本制作流程更加簡單，末端配對序列長度較DGS技術的兩末端序列更易設計有效的PCR引物擴增變異片段。根據計算機模擬分析結果，建立了CATG-AATT限制性片段實驗流程，并成功用于Yoruba基因組和兩個乳腺癌基因組的CATG-AATT樣本制備。
　　 結論及意義:
　　 1、成功構建了同種移植排斥CD4+T細胞SAGE文庫和同系移植CD4+T細胞SAGE文庫，豐富了開放的SAGE數據庫系統(tǒng)CD4+T細胞

19、的相關信息。應用SAGE技術和GLGI技術，確定了185個同種移植CD4+T細胞相關的差異表達低拷貝基因。通過對SAGE技術在移植領域的應用闡明了SAGE技術在疾病相關差異表達基因研究中的優(yōu)勢和問題，對將來選擇SAGE技術進行疾病基因組研究具有指導意義。
　　 2、應用Solexa和SOLiD測序原理，成功創(chuàng)建了的簡便、省時、基因組信息覆蓋量大、分辨率高、計算機數據分析簡單的改良的體內DGS技術和簡化的體外DGS技術，為進行大規(guī)

20、模疾病基因組研究提供了更加高效的研究工具。
　　 3、創(chuàng)建了限制性片段測序全基因組掃描技術。該技術繼承了末端測序DGS技術省時、簡便和數據分析簡單的優(yōu)勢，進一步簡化了DGS技術的樣本制作流程，提高了基因組分析的覆蓋度和分辨率，并且可以根據不同研究要求產生不同的限制性片段，為功能基因組技術從大型基因組研究中心轉移到常規(guī)實驗室奠定了基礎。
　　 創(chuàng)新點:
　　 1、成功構建首個同種移植排斥CD4+T細胞SAGE文庫。

21、以全轉錄組mRNA測序的SAGE技術和GLGI技術為基礎，發(fā)現了CD4+T細胞中大量新的移植相關基因，豐富了移植排斥相關基因信息。
　　 2、成功創(chuàng)建了改良的體內DGS技術和簡化的體外DGS技術，為在kb分辨率水平進行大規(guī)模疾病基因組掃描建立了更加高效、簡便的工具，并成功應用于8個家族性乳腺癌患者B淋巴細胞基因組PstⅠ ditags文庫的構建。
　　 3、成功創(chuàng)建了基于Solexa和SOLiD測序原理的限制性片段全基因