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文檔簡介
1、膀胱癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率居于所有惡性腫瘤的第九位,在我國,男性膀胱癌發(fā)病率位居全身腫瘤的第八位,女性排在第十二位以后。近年來,隨著我國工業(yè)化進(jìn)程以及人群飲食結(jié)構(gòu)的改變,部分城市腫瘤發(fā)病率報告顯示,膀胱癌發(fā)病率有逐年增高的趨勢。 膀胱癌的發(fā)生是多因素、多步驟的復(fù)雜病理變化過程,既有內(nèi)在的遺傳因素,又有外在的環(huán)境因素。流行病學(xué)研究表明,較為明確的兩大致病危險因素分別是吸煙和長期接觸工業(yè)化學(xué)產(chǎn)品。正常膀胱細(xì)胞惡變起始于DNA及基因表
2、達(dá)水平的改變。基于僅從膀胱癌發(fā)生機(jī)制的單因子分析模式或基因組、轉(zhuǎn)錄或蛋白翻譯水平單一層次分析模式,不能系統(tǒng)地闡明膀胱癌早期發(fā)病的特點(diǎn)和規(guī)律,無法對早期膀胱粘膜病變的最終轉(zhuǎn)歸作出科學(xué)的評價與分析。 隨著具有大規(guī)模、高通量基因和蛋白分析的生物芯片技術(shù)平臺的建立,以及生物信息學(xué)手段和方法的不斷完善,使得從多因子和多層次動態(tài)分析膀胱癌的發(fā)病機(jī)制研究成為可能。同時,實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)明,不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常
3、規(guī)PCR相比,它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn),目前在DNA和RNA的PCR產(chǎn)物定量、基因表達(dá)研究、遺傳病診斷、病原體檢測等方面已得到廣泛應(yīng)用,可以有效的對基因芯片的檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行定量驗(yàn)證。 采用流行病學(xué)病例對照研究方法,分析篩選出的基因作為一種機(jī)體本身的生物學(xué)暴露可疑危險因素,其暴露程度在膀胱癌與正常人膀胱粘膜之間的差異是否具有顯著性意義,該基因的表達(dá)差異與膀胱癌的聯(lián)系強(qiáng)度如何等等,對于判斷芯片篩選結(jié)
4、果的可靠性如何,哪些基因最具有應(yīng)用價值,并進(jìn)一步明確可用于膀胱癌檢測的高度敏感性標(biāo)志基因具有重要意義。 成功篩選出膀胱癌癌變的生物分子標(biāo)志譜及腫瘤標(biāo)志基因,補(bǔ)充與膀胱癌發(fā)生相關(guān)疾病、膀胱癌發(fā)生的分子機(jī)制及膀胱癌早期病變的分子調(diào)控的流行病學(xué)研究,結(jié)合基于臨床內(nèi)鏡的早癌診斷技術(shù),有望成為克服現(xiàn)有問題和明顯提高早癌診斷最有效的途徑之一,并在膀胱癌篩查、診斷和治療方面取得顯著的成績,進(jìn)而對膀胱癌的臨床處理和患者預(yù)后獲得實(shí)質(zhì)性的影響。
5、 研究目的: 采用全基因組芯片繪制出中國廣東人群膀胱癌癌變的生物分子標(biāo)志譜,研究膀胱癌發(fā)生的分子機(jī)制,篩選出腫瘤特異性差異基因,擴(kuò)大樣本數(shù)量采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對基因芯片篩選的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,并采用流行病學(xué)病例對照研究方法,最終篩選出了可用于膀胱癌易感性預(yù)測、早期診斷及疾病監(jiān)測,分子靶向治療的高度敏感性腫瘤標(biāo)志基因。 研究方法: 1.標(biāo)本的收集自南方醫(yī)院泌尿外科取正常膀胱移行上皮組織、肌層浸潤性(T2以上
6、)膀胱癌組織各10例用于基因芯片篩選,各45例用于實(shí)時定量PCR驗(yàn)證。 2.標(biāo)本總RNA提取及質(zhì)量檢定采用Qiagen Rneasy微量抽提試劑盒抽提其總RNA,Agilent2100 bioanalyzer檢定標(biāo)本總RNA質(zhì)量。 3.RNA標(biāo)本的線性熒光擴(kuò)增標(biāo)記及質(zhì)量檢定采用Agilent公司生產(chǎn)的低樣品量RNA線性擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行雙色熒光標(biāo)記,Agilent2100 bioanalyzer檢定標(biāo)記好的cRNA質(zhì)量。
7、 4.70mer寡核苷酸芯片的制備、基因芯片雜交、掃描檢測用Cartesian Pixsys5500基因芯片打印儀點(diǎn)樣Qiagen70mer寡核苷酸探針制備芯片,將上述標(biāo)記好的樣品共10組,分別與制備好的基因芯片進(jìn)行雜交,采用Axon Genepix4000A基因芯片掃描儀進(jìn)行雜交結(jié)果的掃描,Genepix pro6.0軟件數(shù)據(jù)分析。 5.芯片雜交結(jié)果的聚類分析采用Cluster軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,并采用Java Tree
8、view軟件顯示浸潤性膀胱癌與正常膀胱移行上皮組織的基因表達(dá)譜差異。 6.差異基因的Panther Pathway分析采用Panther數(shù)據(jù)庫對上述篩選到的共同表達(dá)上調(diào)以及下調(diào)基因所涉及到的信號通路進(jìn)行檢索分析。 7.差異基因的實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測采用Qiagen Rotor-Gene SYBR Green RT-PCR試劑盒設(shè)置PCR反應(yīng),并用Rotor Gene6000實(shí)時熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測,驗(yàn)證了
9、篩選出的6個膀胱癌表達(dá)上調(diào)基因。 8.膀胱癌基因易感性的流行病學(xué)研究 8.1采用病例對照研究顯著性檢驗(yàn)(X2檢驗(yàn))比較病例組與對照組對待測的6個基因的暴露比例是否有顯著性差異,并判斷這些基因的高表達(dá)是否與膀胱癌的發(fā)生有統(tǒng)計(jì)學(xué)聯(lián)系; 8.2通過比值比(OR)分析,獲得病例組與對照組暴露比值之比,從而反映基因高表達(dá)因素與膀胱癌之間的聯(lián)系強(qiáng)度。并進(jìn)一步采用Miettinen法估計(jì)OR的95%可信區(qū)間。 結(jié)論:
10、 1.本研究采用70mer全基因組寡核苷酸基因芯片,對10對浸潤性膀胱癌標(biāo)本及正常膀胱移行上皮的19568個基因的表達(dá)譜差異同時進(jìn)行了研究,獲得了廣東人膀胱癌癌變的生物分子標(biāo)志譜,共篩選到腫瘤差異表達(dá)基因152個,涉及已知的多條信號通路,包括已知直接與膀胱癌相關(guān)或與腫瘤發(fā)生相關(guān)的通路。充分證明浸潤性膀胱癌的發(fā)生是一個涉及多基因、多步驟、多通路調(diào)控的復(fù)雜過程。所獲得的膀胱癌癌變的生物分子標(biāo)志譜及篩選出的腫瘤標(biāo)志基因,對于研究廣東人膀
11、胱癌發(fā)生的分子機(jī)制及膀胱癌的臨床早期診療具有重要意義。 2.通過擴(kuò)大樣本量,采用實(shí)時熒光定量PCR方法,對芯片檢測的FASN、STMN1、SPINT2、TYMS、VEGF、KRT196個表達(dá)上調(diào)基因的表達(dá)情況進(jìn)行了定量分析,采用流行病學(xué)病例對照研究方法進(jìn)行研究,對基因芯片篩選的結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證,并最終篩選出了與膀胱癌發(fā)生密切相關(guān)的高度敏感性腫瘤標(biāo)志基因TYMS和VEGF,這些基因不僅可以用于膀胱癌的易感性預(yù)測、早期診斷及疾病監(jiān)測,
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