高通量篩選腫瘤預(yù)防藥物技術(shù)平臺(tái)的建立及中醫(yī)藥應(yīng)用研究.pdf

1、“應(yīng)用天然或人工合成的化合物去阻斷、逆轉(zhuǎn)或預(yù)防侵襲性腫瘤的發(fā)生”，即腫瘤的化學(xué)預(yù)防(Chemoprevention)。國際癌癥中心曾指出，在復(fù)雜多樣的致癌因素中，80％～90％的人類腫瘤是由化學(xué)致癌物引起的?；瘜W(xué)致癌物可損傷細(xì)胞DNA，使基因發(fā)生突變，從而引起腫瘤。腫瘤預(yù)防研究的目的之一就是尋找高效、低毒的藥物。由于化學(xué)藥品的毒副作用以及人們認(rèn)識(shí)到“回歸大自然”的重要性，天然藥物在腫瘤預(yù)防中所起到的作用，日益受到重視。我國有著寶貴、豐富

2、的中藥資源，如何高通量地從中藥中篩選出預(yù)防腫瘤的有效成分，己成為一個(gè)迫切需要解決的瓶頸問題。
　　 目前，國內(nèi)外應(yīng)用于藥物篩選的模型大致分為三類：整體動(dòng)物水平模型、組織器官水平模型和細(xì)胞分子水平模型。前兩種模型往往消耗樣品量大，要使用大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，勞動(dòng)強(qiáng)度高，耗時(shí)耗力，并且一次試驗(yàn)篩選樣品量有限，不適合成分復(fù)雜的中藥有效活性成分的篩選。細(xì)胞分子水平的藥物篩選模型具有材料用量少、省時(shí)高效、藥物作用機(jī)制比較明確、可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的篩選

3、等特點(diǎn)，但在分子和細(xì)胞水平上對化學(xué)預(yù)防劑的有效鑒別的研究還相當(dāng)缺乏，通過建立轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型對預(yù)防腫瘤中藥進(jìn)行高通量篩選的研究，國內(nèi)外均未見報(bào)道。
　　 本研究旨在建立一種簡便易行、高度敏感和高效率的篩選腫瘤預(yù)防藥物的細(xì)胞模型，并用于從現(xiàn)有中藥中篩選預(yù)防腫瘤的有效成分。
　　 1.應(yīng)用重組PCR技術(shù)，以質(zhì)粒pRL-TK為模板，獲得重組TK啟動(dòng)子，并在其基本啟動(dòng)子上游引入SacⅠ酶切位點(diǎn)。將TK啟動(dòng)子片段克隆入pMD18-T

4、載體中，構(gòu)建載體pMD-TK。用SalⅠ和BamHⅠ對質(zhì)粒pMD-TK和pEGFP進(jìn)行雙酶切，將TK啟動(dòng)子連接到載體pEGFP中構(gòu)建載體pTK-GFP。再以質(zhì)粒pTK-GFP為模板擴(kuò)增TK目的片段，用VspⅠ和BamHⅠ對擴(kuò)增出的TK目的片段和載體pEGFP-N1進(jìn)行酶切，將TK啟動(dòng)子連接到載體pEGFP-N1上，構(gòu)建真核報(bào)告載體pTK-GFP/neo。人工合成的4個(gè)ARE序列，經(jīng)退火磷酸化后逐個(gè)連接到載體pTK-GFP/neo上。首次

5、在國內(nèi)分別構(gòu)建了真核報(bào)告載體pARE-TK-GFP/neo、p2ARE-TK-GFP/neo、p3ARE-TK-GFP/neo和p4ARE-TK-GFP/neo。
　　 2.真核報(bào)告載體pTK-GFP/neo、pARE-TK-GFP/neo、p2ARE-TK-GFP/neo和p4ARE-TK-GFP/neo用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，24 h后在熒光顯微鏡下觀察到4種細(xì)胞都發(fā)出綠色熒光，說明啟動(dòng)子的選擇是較為合適的。接著用600

6、μg/mLG418篩選出陽性細(xì)胞克隆。首次在國內(nèi)構(gòu)建了無ARE調(diào)控的細(xì)胞模型HepG2-TK-GFP和不同ARE重復(fù)序列調(diào)控的細(xì)胞模型HepG2-ARE-TK-GFP、HepG2-2ARE-TK-GFP、HepG2-3ARE-TK-GFP和HepG2-4ARE-TK-GFP。
　　 3.HepG2-TK-GFP、HepG2-ARE-TK-GFP、HepG2-2ARE-TK-GFP和HepG2-4ARE-TK-GFP細(xì)胞擴(kuò)增后，經(jīng)

7、胰酶消化，接種入黑色96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)為5×104個(gè)，培養(yǎng)24 h后，除對照孔外，各孔加入終濃度為100μM的tBHQ，并設(shè)5個(gè)重復(fù)。24小時(shí)后用PBS洗滌，再加入100μg/mL EB200μL室溫下染色20 min，再用PBS洗滌1次后加入200μL PBS，用多功能熒光酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞的GFP和EB熒光強(qiáng)度，求其相對發(fā)光度。結(jié)果HepG2-4ARE-TK-GFP細(xì)胞的GFP誘導(dǎo)表達(dá)水平最高，為HepG2-TK-GFP細(xì)胞的

8、6倍，選用該細(xì)胞中對GFP具有最高表達(dá)水平和最低基礎(chǔ)水平的克隆做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 4.將HepG2-TK-GFP和HepG2-4ARE-TK-GFP細(xì)胞擴(kuò)增后，接種入黑色96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度(0(DMSO對照)、12.5、25、50、100、200μM)的陽性受試物PDTC和tBHQ。每濃度設(shè)5個(gè)重復(fù)，作用24 h后用PBS洗滌，加入EB染色，用多功能熒光酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞的GFP和EB熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示PD

9、TC和tBHQ對HepG2-TK-GFP細(xì)胞的GFP熒光均無誘導(dǎo)作用，其熒光強(qiáng)度呈不規(guī)則變化，各濃度組之間差異不顯著(P＞0.05)；PDTC誘導(dǎo)的HepG2-4ARE-TK-GFP細(xì)胞中的GFP熒光隨著PDTC濃度的升高，熒光表達(dá)水平呈先上升后下降的趨勢，具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。在濃度為50μM時(shí)誘導(dǎo)效果最好，與對照組比較差異有顯著性(P＜0.05)；tBHQ誘導(dǎo)的HepG2-4ARE-TK-GFP細(xì)胞中的GFP熒光隨著tBHQ濃度的

10、升高，熒光表達(dá)水平持續(xù)上升，各組(12.5，25，50，100，200μM)與對照組比較差異都有顯著性(P＜0.05)，且具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。從而證實(shí)本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的這種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型可用來篩選不同結(jié)構(gòu)性質(zhì)的化學(xué)預(yù)防劑。
　　 5.以質(zhì)粒pDsRed2-N1為模板擴(kuò)增紅色熒光蛋白及啟動(dòng)子片段克隆入載體pMD18-T上，構(gòu)建載體pMD-DsRed。用AdeⅠ和BspTⅠ對載體pMD-DsRed和p4ARE-TK-GFP/neo進(jìn)

11、行雙酶切，將目的紅色熒光蛋白及啟動(dòng)子片段連接到載體p4ARE-TK-GFP/neo上，構(gòu)建真核報(bào)告載體p4ARE-TK-GFP/DsRed/neo。該載體用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，并用G418篩選出陽性細(xì)胞克隆。首次構(gòu)建了以GFP為第一信號(hào)，以紅色熒光蛋白為第二信號(hào)的細(xì)胞模型HepG2-4ARE-TK-GFP/DsRed。將該細(xì)胞接種入黑色96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度(0(DMSO對照)、12.5、25、50、100、20

12、0μM)的陽性受試物PDTC和tBHQ。所得結(jié)果與HepG2-4ARE-TK-GFP細(xì)胞模型中的結(jié)果基本一致，證實(shí)對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型HepG2-4ARE-TK-GFP的完善是成功的，使篩選更簡單、更方便、更準(zhǔn)確。
　　 6.首次利用HepG2-4ARE-TK-GFP細(xì)胞模型對22種中藥單體、3種中藥有效部位、復(fù)方六味地黃膠囊、四君子湯以及組成兩方的各單味中藥的提取物進(jìn)行了篩選，結(jié)果中藥單體中穿心蓮內(nèi)酯、黃芩苷、大黃酸、大黃素、槲皮

13、素、大豆苷元、熊果酸、白藜蘆醇顯示結(jié)果為陽性，且都具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，提示8種單體能誘導(dǎo)Ⅱ相酶表達(dá)起到化學(xué)預(yù)防作用；三種有效部位中半枝蓮總黃酮注射液和黃芪注射液顯示結(jié)果為陽性，提示其阻斷癌前病變和抗突變的作用可能是通過誘導(dǎo)Ⅱ相酶表達(dá)實(shí)現(xiàn)的；復(fù)方六味地黃膠囊和四君子湯的顯示結(jié)果為陽性，單味中藥提取物中熟地黃、人參、白術(shù)顯示結(jié)果為陽性。其中復(fù)方六味地黃膠囊效果優(yōu)于該方中的單味中藥熟地黃，提示其誘導(dǎo)效果可能是因?yàn)閺?fù)方產(chǎn)生了新的成分或是各成