111.基于多尺度創(chuàng)新原理的工業(yè)微生物高通量篩選平臺(tái)構(gòu)建及應(yīng)用研究

1、分類號(hào)UDC：密級(jí)華東理工大學(xué)學(xué)位論文基于多尺度創(chuàng)新原理的工業(yè)微生物高通量篩選平臺(tái)構(gòu)建及應(yīng)用研究譚俊指導(dǎo)教師姓名：儲(chǔ)炬教授華東理工大學(xué)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)名稱：生物化工論文定稿日期：20121225論文答辯日期：20130220學(xué)位授予單位：蘭查望三丕芏學(xué)位授予日期：答辯委員會(huì)主席評(píng)閱人陳代杰朱春寶、張毅沈亞領(lǐng)、趙風(fēng)生李柏林華東理工大學(xué)博士學(xué)位論文第1頁基于多尺度創(chuàng)新原理的工業(yè)微生物高通量篩選平臺(tái)構(gòu)建及應(yīng)用研究摘要菌種是發(fā)酵技術(shù)的源頭

2、，菌種發(fā)酵水平是決定企業(yè)產(chǎn)品能否參與市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的技術(shù)保證，因此，微生物高通量篩選技術(shù)的研究和應(yīng)用是提升工業(yè)發(fā)酵技術(shù)的必由之路。本論文通過流體動(dòng)力學(xué)模擬深孔板與普通搖瓶的液體流動(dòng)速度與剪切力分布，研究微型化培養(yǎng)過程中的氧傳遞、物料混合等科學(xué)問題，解決高耗氧微生物的微型化培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)。論文先以高耗氧絲狀真菌頂頭孢霉為研究對(duì)象，構(gòu)建了靈活通用型菌株高通量篩選模型，再以好氧菌紅色糖多孢菌和紅曲霉為高通量分析及微型化培養(yǎng)對(duì)象，驗(yàn)證了高通量篩選平臺(tái)

3、的準(zhǔn)確與可行性，進(jìn)一步推廣了高通量篩選技術(shù)的應(yīng)用。首先以頂頭孢霉為研究對(duì)象，建立了提高篩選效率防止漏篩的高通量菌種篩選方法。即將所有誘變后孢子懸液等分至深孔板，同時(shí)培養(yǎng)與檢測(cè)，先篩選出具有高產(chǎn)特性的存在于孔板中某一深孔中的混合菌群，再進(jìn)一步從中分離純化獲得高產(chǎn)菌株。所構(gòu)建的高通量篩選方法提供給誘變株平等的篩選機(jī)會(huì)，有效克服了傳統(tǒng)篩選的漏篩問題。將此高通量篩選方法成功應(yīng)用于頭孢菌素C(CPC)高產(chǎn)菌株篩選，成功獲得了一株頂頭孢霉高產(chǎn)菌株W

4、6，在50L發(fā)酵罐上CPC產(chǎn)量比出發(fā)菌株lD1提高了近2倍。接著開展了基于多尺度創(chuàng)新原理的菌種篩選后技術(shù)的系統(tǒng)研究，分別從代謝特性、菌形變化規(guī)律、酶學(xué)分析、與CPC合成相關(guān)的重要基因轉(zhuǎn)錄水平及定量代謝流分析等角度對(duì)獲得的高產(chǎn)菌株與出發(fā)菌株進(jìn)行了系統(tǒng)分析比較，初步揭示了高產(chǎn)菌株的高產(chǎn)機(jī)理。其中，酶學(xué)水平上，比較了兩菌株在初級(jí)代謝過程中的四種關(guān)鍵酶酶活，分別是葡萄糖一6一磷酸脫氫酶、檸檬酸合成酶、異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶。結(jié)果表明高產(chǎn)菌

5、株的異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶活性明顯提高，因此在補(bǔ)加豆油的情況下，乙醛酸循環(huán)途徑活性的明顯提高是導(dǎo)致CPC產(chǎn)量提高的重要原因。我們還對(duì)CPC合成途徑中的關(guān)鍵酶ACV合成酶、擴(kuò)環(huán)酶／羥化酶、?；D(zhuǎn)移酶的編碼基因pcbAB，cefEF和ceil3進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄水平的比較。高產(chǎn)菌株W6的pcbAB、cefEF、celC在72h的mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別是出發(fā)菌株(1D1)的5、8、12倍；在96h分別是1D1的5、14、15倍：在120h分別是1

6、D1的4、50、7倍。說明進(jìn)入CPC合成期后cefEF轉(zhuǎn)錄差異最大，擴(kuò)環(huán)酶／羥化酶的限制很可能是影響CPC合成增加的重要原因，從而為進(jìn)一步基因改造或優(yōu)化培養(yǎng)條件提供了有益線索。代謝流計(jì)算結(jié)果表明，頂頭孢霉菌絲體內(nèi)的碳主要是在以檸檬酸循環(huán)、乙醛酸循環(huán)和回補(bǔ)途徑進(jìn)行代謝，高產(chǎn)菌株消耗的豆油總量較多，經(jīng)過代謝分解成的C2底物濃度較高，導(dǎo)致其TCA循環(huán)通量較大。高產(chǎn)菌株W6進(jìn)入乙醛酸循環(huán)途徑中的C2底物的通量是出發(fā)菌株的143倍，能夠生成更多的