Illumina高通量測(cè)序技術(shù)觀察剖宮產(chǎn)兒腸道微生物群的演替.pdf

1、目的:腸道微生物與人體健康息息相關(guān)。機(jī)體與腸道微生物群間存在多層面互惠互利的共生關(guān)系，腸道微生物群在幫助消化吸收、抵抗致病微生物定植，促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育和成熟上均發(fā)揮著重要作用。嬰兒期是腸道微生物群體系建立的關(guān)鍵時(shí)期。分娩方式是影響腸道微生物群的初始定植的重要因素，此時(shí)期腸道微生物群紊亂可能與遠(yuǎn)期如過(guò)敏、肥胖等多種疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。目前的對(duì)腸道微生物群的研究多應(yīng)用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR和變性梯度凝膠電泳DGGE，這

2、些方法不僅耗時(shí)而且工作量大，只能檢測(cè)出一定豐度以上的微生物，對(duì)復(fù)雜的腸道微生物群的研究不夠全面。Illumina高通量測(cè)序技術(shù)能夠測(cè)序腸道中所有微生物DNA序列，全面分析腸道微生物落的多樣性和豐度，滿足對(duì)腸道微生物群落的全面認(rèn)識(shí)。本研究采用Illumina Miseq平臺(tái)對(duì)剖宮產(chǎn)兒生后腸道微生物群的初始定植和演替進(jìn)行動(dòng)態(tài)隨訪觀察，目的為完善和補(bǔ)充以往我們?cè)诖朔矫娴难芯績(jī)?nèi)容，為剖宮產(chǎn)兒腸道微生物群落的演替與遠(yuǎn)期機(jī)體健康和疾病的關(guān)系的研究提

3、供理論依據(jù)。
　　方法:收集2013年11月-2014年12月在河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院產(chǎn)科、石家莊市第四醫(yī)院產(chǎn)科分娩的符合入選標(biāo)準(zhǔn)的足月，健康剖宮產(chǎn)兒30例。其嬰兒及雙親均生活在石家莊市或其周邊縣市，氣候環(huán)境，居住環(huán)境相當(dāng)。所有入選對(duì)象均在研究開(kāi)始前簽訂知情同意書(shū)，并獲河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院倫理道德委員會(huì)同意。收集入組嬰兒出生后第1、3、7天，第1個(gè)月、3個(gè)月和6個(gè)月齡（分別設(shè)定為T(mén)1-T6組）時(shí)的糞便標(biāo)本凍存于-80℃冰箱。隨訪入組

4、嬰兒各時(shí)間段的喂養(yǎng)狀況、生長(zhǎng)發(fā)育情況以及用藥情況（抗生素及益生菌制劑）。采用E.Z.N.A.(@) Stool DNA Kit試劑盒提取嬰兒糞便微生物的總DNA，并擴(kuò)增16S rRNA基因的V3+V4可變區(qū)，應(yīng)用IlluminaMiseq平臺(tái)測(cè)序，全面分析腸道微生物群的構(gòu)成，豐度和多樣性。
　　結(jié)果:
　　1入組剖宮產(chǎn)兒共30例，分別采集生后第1、3、7天，第1個(gè)月、3個(gè)月和6個(gè)月齡時(shí)這6個(gè)時(shí)間點(diǎn)糞便標(biāo)本，應(yīng)收集標(biāo)本180份

5、，因各種原因?qū)嵅蓸颖?60份，脫落20份，脫落率為11.1％，其中編號(hào)為3、5、36、46、107、132、138，因標(biāo)本DNA擴(kuò)增失敗，共計(jì)153個(gè)樣本進(jìn)入后續(xù)的高通量測(cè)序分析。對(duì)153份剖宮產(chǎn)兒糞便樣本測(cè)序發(fā)現(xiàn)，共獲得2450420個(gè)有效序列，在經(jīng)過(guò)過(guò)濾處理后得到優(yōu)化序列數(shù)為1892051，總堿基數(shù)870289641bp，平均459.97bp。
　　2稀釋曲線表明本研究測(cè)序深度足夠，能覆蓋腸道微生物群97％的菌種。多樣性分析提

6、示生后隨時(shí)間推移糞便樣本中菌群豐度及多樣性逐漸增加。
　　3對(duì)153份剖宮產(chǎn)兒糞便樣本測(cè)序:在門(mén)水平上共檢測(cè)出14個(gè)菌門(mén)，其中98％-99％以上主要為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)及Candidate division TM7五個(gè)菌門(mén)。
　　430例剖宮產(chǎn)兒糞便微生物群的定植及演替:153份糞便樣品進(jìn)

7、行測(cè)序共測(cè)得183個(gè)菌屬。屬水平上，T1組糞便菌群定植分布相對(duì)均勻，樣本間差異小，以乳球菌屬(Lactococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)及Solibacillus等需氧菌和兼性厭氧菌為優(yōu)勢(shì)菌屬;T2組糞便微生物群構(gòu)成較T1組發(fā)生明顯變化，以埃希氏菌屬(Escherichia-Shigella)、克雷伯桿菌屬(Klebsiella)等兼性厭氧菌為優(yōu)勢(shì)菌群，乳球菌屬、芽孢桿菌屬等所占比例少

8、。T3組糞便標(biāo)本個(gè)體間差異較大，雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium sensustricto)、腸球菌屬(Enterococcus)及韋榮球菌屬(Veillonella)定植增多，埃希氏菌屬(Escherichia-Shigella)、克雷伯桿菌屬(Klebsiella)定植減少。T4組糞便標(biāo)本中雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)定植增至24.5％，克雷伯桿菌屬(Klebsie

9、lla)減少至20％左右，梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium sensustricto)占10％左右。T5組糞便標(biāo)本中雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和埃希氏菌屬(Escherichia-Shigella)為優(yōu)勢(shì)菌屬，克雷伯桿菌屬(Klebsiella)及梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium sensu stricto)定植減少。T6組糞便標(biāo)本間菌屬分布趨于均勻，以雙歧桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。埃希氏菌屬(Escherichi

10、a-Shigella)、克雷伯桿菌屬(Klebsiella)及梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium sensu stricto)仍存在。
　　結(jié)論:
　　1 Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)能夠測(cè)序腸道中所有微生物DNA序列，全面分析腸道微生物落的多樣性和豐度，滿足對(duì)腸道微生物群落的全面認(rèn)識(shí)。
　　2對(duì)剖宮產(chǎn)兒腸道微生物群進(jìn)行了全面分析:(1)在門(mén)水平上，共檢測(cè)出14個(gè)菌門(mén)，98％-99％以上主要為5個(gè)菌門(mén)，分別

11、為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)及Candidate division TM7。(2)在屬水平上共測(cè)得183個(gè)菌屬，主要有埃希氏菌屬、雙歧桿菌屬、克雷伯氏菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、韋榮球菌屬、乳球菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬等。
　　3動(dòng)態(tài)隨訪觀察了剖宮產(chǎn)兒生后腸道微生物群的初始定植、分布和演替
　　3.

12、1門(mén)水平上，剖宮產(chǎn)兒生后6個(gè)月內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)，豐度較高，其次還有放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)。出生后隨時(shí)間推移，厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)是增加的;變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)是降低的。
　　3.2屬水平上，剖宮產(chǎn)兒出生后第1天糞便樣本已有大量細(xì)菌定植，主要為乳球菌屬、芽孢桿菌屬及假單胞菌屬等需氧菌和兼性厭氧菌，其大量生長(zhǎng)繁殖消耗消化道內(nèi)大量氧氣，降低了腸道內(nèi)酸堿度和氧化還原電位，為后期厭氧菌的定植打下基礎(chǔ)，也表現(xiàn)出后期需氧菌和兼性厭氧菌定植