基于高通量測(cè)序的HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭患者腸道菌群特征研究.pdf

1、慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個(gè)威脅全球健康的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題，中國(guó)慢性HBV感染者高達(dá)約9300萬(wàn)，約有10％-30％的患者出現(xiàn)自發(fā)肝炎急性加重(acuteexacerbation，AE)，部分進(jìn)展為輕度肝炎，部分進(jìn)展為重度肝炎以及慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)[1-2]。慢性HBV感染者一旦進(jìn)展為重型肝炎/ACLF，常合并消化道出血、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎(spontaneo

2、us bacterial peritonitis，SBP)、肝性腦病等并發(fā)癥，死亡率極高[3]，盡管生物人工肝等器官衰竭的支持治療已取得進(jìn)步，但仍缺乏特異的內(nèi)科治療手段。最近幾年，ACLF的發(fā)病機(jī)理研究取得諸多進(jìn)展，免疫功能的紊亂失衡、小腸細(xì)菌異常增生所致細(xì)菌易位以及微循環(huán)障礙被認(rèn)為是影響ACLF進(jìn)展的重要因素[4]。
　　在肝硬化及重型肝炎時(shí)，腸道血供及免疫狀態(tài)受到明顯影響，腸道微環(huán)境改變，可能導(dǎo)致腸道微生態(tài)平衡狀態(tài)發(fā)生失衡。自

3、發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎是重型肝炎/慢加急肝衰竭患者的一種常見(jiàn)并發(fā)癥，是導(dǎo)致肝功能惡化的常見(jiàn)誘因之一，腸道微生態(tài)失衡及細(xì)菌易位被認(rèn)為是導(dǎo)致SBP發(fā)生的主要機(jī)制[5]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究也通過(guò)16SrDNA和宏基因組等技術(shù)揭示出腸道菌群在慢性肝臟疾病中的改變，以及腸道微生態(tài)失衡參與慢性肝臟疾病及其各種并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。然而關(guān)于慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)疾病不同階段腸道菌群的變化仍不清，特別是關(guān)于乙肝相關(guān)慢加

4、急性肝衰竭(HBV-ACLF)和CHB疾病不同嚴(yán)重程度的腸道菌群變化仍然不清楚。
　　為了全面分析CHB患者腸道微生態(tài)失衡情況，探索HBV-ACLF的腸道菌群結(jié)構(gòu)變化特征，為理解腸道菌群在重型肝炎病理機(jī)制中的作用提供依據(jù)。第一部分HBV-ACLF患者糞便菌群結(jié)構(gòu)多樣性研究，以HBV-ACLF為研究對(duì)象，慢性乙型肝炎重度(severe chronic hepatitis B，S-CHB)、慢性乙型肝炎輕中度(mild and mod

5、erate chronic hepatitis B，M-CHB)及健康人群(healthy controls，HC)為對(duì)照組，提取糞便樣本基因組DNA，運(yùn)用基于16S rDNA的V3-V4區(qū)高通量測(cè)序方法分析研究對(duì)象的腸道菌群結(jié)構(gòu)、豐度及多樣性特點(diǎn)，研究HBV-ACLF和CHB不同疾病階段腸道菌群的差異及變化特征。第二部分通過(guò)回顧性分析自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎(SBP)患者腹水培養(yǎng)陽(yáng)性的微生物分布特點(diǎn)、通過(guò)16S rDNA高通量測(cè)序探索分析培

6、養(yǎng)陰性腹水樣本細(xì)菌存在的可能性及種類(lèi)，以期探索SBP感染與腸道菌群的關(guān)系，并評(píng)估感染標(biāo)志物降鈣素原(PCT)和血常規(guī)中性粒細(xì)胞在SBP中的變化及診斷效能。本研究主要結(jié)果如下：
　　結(jié)果：
　　1.重型乙型肝炎/HBV-ACLF患者腸道菌群16S rDNA高通量測(cè)序結(jié)果顯示：HBV-ACLF患者腸道菌群OTU數(shù)目、community richness指數(shù)顯著低于M-CHB患者和健康組，提示HBV-ACLF患者腸道菌群豐度顯著降

7、低;NMDS分析顯示HBV-ACLF組可分別與M-CHB組、健康對(duì)照組清晰分開(kāi)，提示HBV-ACLF患者腸道菌群整體結(jié)構(gòu)顯著不同于M-CHB和健康組，去除伴有肝硬化的患者后，NMDS分析仍可清晰區(qū)分，提示HBV-ACLF患者無(wú)論是否伴有肝硬化其腸道菌群結(jié)構(gòu)均發(fā)生顯著變化;
　　2.HBV-ACLF患者腸道菌群發(fā)生廣泛的群落改變，采用M-CHB和HBV-ACLF患者測(cè)序得到的所有菌屬，通過(guò)隨機(jī)森林分析可顯著區(qū)分M-CHB和ACLF患

8、者人群，且獲得屬水平的變量重要性排序。提示采用腸道菌群分類(lèi)注釋的屬水平，可顯著區(qū)分兩種疾病狀態(tài)的患者，不同菌屬在區(qū)分兩組患者時(shí)其變量重要性不同;
　　3.Veillonella,Streptococcus，F(xiàn)usobacterium等22個(gè)屬在HBV-ACLF患者中顯著增高，其豐度升高的程度與TB、INR、MELD評(píng)分呈顯著正相關(guān);Romboutsia等26個(gè)屬顯著富集在M-CHB患者中，其豐度與TB、INR、MELD評(píng)分呈顯著負(fù)

9、相關(guān)，提示48個(gè)特征菌屬與評(píng)價(jià)疾病嚴(yán)重程度的臨床指標(biāo)具有相關(guān)性;
　　4.腸道菌群特征菌屬的豐度在慢乙肝急性發(fā)作不同嚴(yán)重程度表型狀態(tài)下的演替過(guò)程顯示：M-CHB-富集菌屬(MEG)累積豐度作為潛在有益菌，ACLF-富集菌屬(AEG)累積豐度作為潛在致病菌，在HC組（MEG顯著高于AEG，P＜0.05），M-CHB組(MEG顯著高于AEG，P＜0.05)，S-CHB組（MEG接近AEG，P＞0.05），ACLF組（MEG顯著低于AE

10、G，P＜0.05）;隨著疾病的加重MEG累積豐度顯著降低，AEG累積豐度顯著增高，ACLF患者中兩類(lèi)菌屬豐度比例倒置;
　　5.自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎特點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，SBP患者的腹水培養(yǎng)陽(yáng)性率低，腹水培養(yǎng)常見(jiàn)細(xì)菌為大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、鏈球菌屬、葡萄球菌屬等;有腹膜刺激征的患者但培養(yǎng)陰性的腹水樣本經(jīng)16S rDNA高通量測(cè)序初步探索分析提示可能存在一種或幾種細(xì)菌或細(xì)菌DNA;腹水中檢出的細(xì)菌種類(lèi)與HBV-ACLF患者腸道菌群中異常

11、增高的潛在致病菌種類(lèi)部分一致;
　　6.通過(guò)ROC曲線分析評(píng)估感染指標(biāo)血降鈣素原(PCT)和血常規(guī)中性粒細(xì)胞比例在SBP患者中的診斷效能，結(jié)果顯示PCT在SBP1組（培養(yǎng)陽(yáng)性&PMN≥250×106/L），SBP2組（培養(yǎng)陽(yáng)性&PMN＜250×106/L），SBP3組(培養(yǎng)陰性&PMN≥250×106/L)的最佳CUT-OFF值分別為：0.795ng/mL、0.265ng/mL、0.405ng/mL;AUC值依次為：0.963、0

12、.767、0.714;敏感度依次為：100.00％、90.00％、62.30％;特異度依次為：92.70％、63.40％、80.50％;血常規(guī)Neu％診斷的最佳界值分別為：68.45％、62.65％、65.00％;AUC值依次為：0.878、0.756、0.669。依據(jù)上述界值，降鈣素原和中性粒細(xì)胞比例兩者串聯(lián)診斷SBP1、SBP2、SBP3組的AUC值依次為：0.976、0.865、0.706。
　　結(jié)論：
　　本研究基于

13、高通量測(cè)序方法首次分析并揭示了HBV-ACLF及CHB不同疾病進(jìn)展階段的腸道菌群紊亂特征，隨著CHB疾病嚴(yán)重程度的增加，腸道菌群呈現(xiàn)進(jìn)行性、結(jié)構(gòu)性紊亂，整體群落豐度顯著降低;HBV-ACLF患者腸道菌群顯著區(qū)別于M-CHB患者，其腸道菌群的平衡被打破，潛在致病菌和有益菌豐度比例倒置;HBV-ACLF患者腸道菌群中異常增高的潛在致病菌種類(lèi)與SBP患者腹水中檢出的細(xì)菌種類(lèi)部分一致;本研究提示異常增高的潛在致病菌可能增加感染風(fēng)險(xiǎn)從而在ACLF