腸道微生物群落結構的分子分析.pdf

1、腸道菌群對宿主的消化、免疫和抗病等功能具有重要的影響。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術不能客觀全面地反映腸道菌群的結構特征。本研究應用分子生物學技術對人和動物(昆蟲和大熊貓)腸道微生物群落結構進行了研究。 過去的研究表明，人的腸道菌群結構具有顯著的個體差異，但健康的個體會共有一些類群，對人體健康影響可能較大。如何通過比較不同健康狀況的個體的腸道菌群結構發(fā)現(xiàn)這些健康個體所共有的微生物類群是一個很有意義的研究課題。本研究發(fā)展和建立了一種基于ERI

2、C-PCR(EnterobacterialRepetitiveIntergenicConsensus[ERIC]PCR)指紋圖分析的新方法用于尋找健康腸道共有菌群的分子標記。其核心是用ERIC-PCR比較不同腸道微生物群落的結構特征并結合DNA雜交鑒定健康個體樣品中共有的基因組片段。12例不同健康狀況的人和豬糞便樣品的ERIC-PCR指紋圖表明每例個體具有獨特而穩(wěn)定的指紋圖。用地高辛把一個健康兒童樣品的ERIC-PCR混合產(chǎn)物標記作為探

3、針，在嚴謹條件下雜交，對不同樣品中同樣大小的條帶的DNA片段的序列同源性進行了分析。雜交圖譜與原來的凝膠電泳指紋圖譜的比較分析表明有(500bp、800bp和1000bp)3個條帶是健康腸道樣品共有的特征條帶。針對這3個條帶分別建立克隆文庫分析其中的DNA序列多樣性，結果得到17個基因組片段，其中3個與Bacteroidesthetaiotaomicron的基因組區(qū)域具有很高的同源性，其余片段是所謂“孤兒序列”，在GenBank中沒有發(fā)

4、現(xiàn)任何具有顯著同源性的序列。用序列專一性PCR實驗檢驗了其中豐度最高的7個片段在健康腸道中出現(xiàn)的概率，結果表明，有一個片段出現(xiàn)在所有32個健康人和13只健康仔豬的腸道里，但在腹瀉兒童腸道里很少出現(xiàn)；有2個片段在健康人組和發(fā)生非感染性腹瀉的兒童組腸道里出現(xiàn)，但在發(fā)生感染性腹瀉的兒童腸道里基本檢測不到。用本研究發(fā)展的這種新的技術方法可以克隆到健康腸道共有的微生物類群的基因組片段，作為相應細菌的分子標記，可以設計專一性的引物和探針，既可用于研

5、究相應的細菌在腸道中的動力學變化與宿主健康的關系，也可用于其在序列引導下的分離。我們的研究還表明，本方法并不局限于使用ERIC引物，依據(jù)長引物隨機PCR原理設計的引物很多都可以用于分析微生物群落結構，而且本方法也不局限于分析比較腸道微生物群落結構，它在各類不同的微生物群落結構分析中都具有應用潛力。 宿主遺傳特性對腸道菌群結構的影響是腸道生態(tài)學中一個重要的科學問題。我們用16SrDNA克隆文庫分析和16SrDNAV3區(qū)PCR-TG

6、GE指紋圖分析方法對棉鈴蟲(H.armigera)和煙青蟲(H.assulta)這兩種近緣昆蟲的腸道菌群進行了分析。結果表明，食譜廣泛的棉鈴蟲比食譜狹窄的煙青蟲具有較高的腸道菌群多樣性。棉鈴蟲腸道中的優(yōu)勢菌類型是Ochrobactrumsp.，而煙青蟲的是Lactobacillusmali。這兩種供試昆蟲在同樣的飼養(yǎng)環(huán)境和人工飼料上連續(xù)飼養(yǎng)了10代以上，但卻建立了具有顯著差異的腸道菌群結構。本研究表明宿主遺傳特性在決定腸道菌群結構中具有

7、比環(huán)境條件更重要的作用。 大熊貓是食肉目動物，具有與食肉動物相似的腸道結構，但卻主要以竹子為食，而且消化率只有20﹪。本研究以飼養(yǎng)在兩個動物園的2只成年和1只幼年大熊貓為對象，用基于16SrDNA的方法分析了其腸道優(yōu)勢菌的多樣性。16SrDNAV3區(qū)的PCR-TGGE指紋圖分析表明這些個體之間的腸道菌群結構相似性較高，其TGGE圖譜間的相似性系數(shù)超過60﹪。3只個體共有1條優(yōu)勢主帶，經(jīng)測序分析是大腸桿菌。用1只雄性成年大熊貓的腸