轉(zhuǎn)基因水稻根際固氮微生物群落結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、轉(zhuǎn)基因水稻環(huán)境安全性問題是研究者關(guān)注的焦點(diǎn)之一。有關(guān)轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)稻田土壤微生物的影響目前仍知之甚少。固氮微生物是水稻根際微生物群落中重要的微生物功能菌群之一，對(duì)水稻氮素營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)起著重要作用。本論文重點(diǎn)利用功能基因法對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻根際固氮微生物群落多樣性進(jìn)行了研究。
　　 主要內(nèi)容和結(jié)論如下：
　　 1 、三種土壤微生物總DNA提取方法的比較。本研究對(duì)3種常用的土壤微生物總DNA提取方法Martin法、高鹽改進(jìn)法及試劑盒法進(jìn)

2、行了比較，并通過DNA得率、純度及16S rDNAV3可變區(qū)的PCR擴(kuò)增結(jié)合DGGE法(denaturing gradient gel electrophoresis)，分別對(duì)3種方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，三種方法均能達(dá)到土壤微生物多樣性PCR-DGGE分析的要求。其中，試劑盒提取方法的DGGE條帶更為均勻，能更好地代表土壤微生物多樣性。與試劑盒法相比，Martin法和高鹽改進(jìn)法由于純化不夠完全，DNA提取液中的雜質(zhì)等可能影響PCR擴(kuò)增反

3、應(yīng)，造成DGGE分析中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶數(shù)目的微小變化，從而可能會(huì)給土壤微生物多樣性分析帶來偏差。理想的解決方案是，DGGE結(jié)合目的條帶回收、測(cè)序以保證土壤微生物多樣性分析的可靠性。三種方法中，試劑盒方法操作簡(jiǎn)單，提取的DNA質(zhì)量較高，但DNA得率較低且成本昂貴。Martin法和高鹽改進(jìn)法用時(shí)較長(zhǎng)，DNA得率較高，純度較低，但對(duì)后續(xù)PCR擴(kuò)增和DGGE分析沒有明顯影響，且成本低廉。在本論文中選用試劑盒方法為提取水稻根際土壤微生物DNA的

4、方法。
　　 2 、轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)根際固氮微生物群落多樣性的影響。本研究以轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)（轉(zhuǎn)Bt）與轉(zhuǎn)基因水稻抗優(yōu)97（轉(zhuǎn)Xa21）及對(duì)照非轉(zhuǎn)基因水稻中鑒為材料，通過提取土壤微生物DNA ，對(duì)固氮微生物進(jìn)化保守基因nifH進(jìn)行PCR擴(kuò)增、序列比對(duì)及分類單元分析，分析轉(zhuǎn)基因水稻及非轉(zhuǎn)基因水稻根際固氮微生物群落。轉(zhuǎn)基因水稻（科豐6號(hào)、抗優(yōu)97）與非轉(zhuǎn)因水稻（中鑒）根際固氮微生物的豐富度指數(shù)及優(yōu)勢(shì)度指數(shù)等均無明顯差別。通過建立系統(tǒng)發(fā)

5、育樹，對(duì)三種水稻根際的固氮微生物群落進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，本研究發(fā)現(xiàn)：三個(gè)水稻品種的根際固氮微生物類群主要分為兩大類，一類是變形菌門（proteobacteria ）其中包括α-Proteobacteia ，γ-Proteobacteria ，β-Proteobacteria 與δ-proteobacteria 另一大類為厚壁菌門（Firmicutes）。中鑒與科豐6號(hào)的根際固氮微生物超過半數(shù)是屬于γ-proterbact eria ，抗

6、優(yōu)97的根際固氮微生物在這一菌門中所占的比例明顯低于其它兩個(gè)水稻品種，在其它各菌門中，轉(zhuǎn)基因水稻與非轉(zhuǎn)基因水稻根際固氮菌的種類無明顯差別。而且本文中研究的絕大部分固氮菌群屬于具有典型鉬-鐵固氮酶特性group I ，小部分屬于具有厭氧鉬-鐵固氮酶特性的group II 。分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)(轉(zhuǎn)Bt)與抗優(yōu)97（轉(zhuǎn)Xa21）與非轉(zhuǎn)基因水稻根際固氮微生物多樣性沒有明顯差別，轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)根際固氮微生物群落沒有顯著影響。